還陽參UPLC 指紋圖譜及化學計量學分析

苗雨露，張雯霞，張文智，馮 敏，李媛媛，倪 艷*

（1.山西省中醫藥研究院，山西 太原 030045；2.山西中醫藥大學，山西 太原 030619）

還陽參為菊科植物還陽參屬屠還陽參Crepis crocea（Lamk）Babc 的干燥全草，最早收載于 《內蒙古中草藥》，其味苦，性微寒，有益氣、止咳平喘、清熱解毒之功效，主產于山西、內蒙古等北部地區，別名為 “驢打滾兒草”“屠還陽參”等［1］。其使用歷史悠久，現已被《山西省中藥材中藥飲片標準》收錄。民間常用還陽參煎湯醫治喘息性慢性支氣管炎、無名腫毒等，治療效果明顯。本課題組從1998 年開始對還陽參進行資源調查，并用科學的方法研究其藥理作用和化學成分，以期闡明其安全性和有效性。課題組針對還陽參藥理作用及化學成分進行研究，并確認其止咳平喘、益氣作用的活性物質。藥效實驗結果表明，還陽參醇提物石油醚部位通過減少小鼠咳嗽次數、延長小鼠咳嗽潛伏期發揮止咳作用［2］，正丁醇部位通過抑制組胺和乙酰膽堿對豚鼠引起的哮喘發揮平喘作用［3］。除此之外，還研究了還陽參止咳平喘藥效物質基礎，且從其活性部位分離出一些化學成分，均為首次從中分離得到［4］。《山西省中藥材中藥飲片標準》中以綠原酸的含有量（不少于0.06%）作為質控標準［5］。

UPLC 指紋圖譜能較全面地得到中藥中的化學成分的相對含有量，更好地評價藥材質量［6-13］。其作為中藥研究領域使用較多且較有效的手段之一，該方法操作簡便、穩定、應用便捷。本實驗建立還陽參UPLC 指紋圖譜，結合化學計量學綜合評價還陽參藥材，以期找到指標成分，建立更合理的質量標準。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1290 infinity Ⅱ高效液相色譜儀、Agilent G4 212 A DAD 檢測器、ChemStation 色譜數據工作站（美國Agilent 公司）；FW-100 型高速萬能粉碎機（北京中興偉業儀器有限公司）；LC-300B 型數控超聲波清洗機（山東濟寧魯超聲設備有限公司）；SE402F 奧豪斯型電子分析天平（奧豪斯儀器上海有限公司）。

1.2 試藥 樣品信息見表1，經山西省中醫藥研究院倪艷教授鑒定為菊科植物屠還陽參Crepis crocea（Lamk）Babc的干燥全草。綠原酸對照品（批號110753-201314，含有量大于98%）、咖啡酸對照品（批號110885-200102，含有量大于98%）均購于中國食品藥品檢定研究院。甲醇、乙腈（色譜純，西隴科學股份有限公司）；甲酸（分析純，批號20030602，北京北化精細化學品有限責任公司）；水為超純水。

表1 樣品信息

2 方法

2.1 色譜條件 Zorbax SB-C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～20 min，5%～10% A；20～30 min，10%～20% A；30～40 min，20%～50% A；40～41 min，50%～5% A；41～45 min，5%A）；體積流量0.3 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量1 μL；檢測波長329 nm。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取綠原酸、咖啡酸對照品，加入甲醇制備成含綠原酸 0.125 1 mg/mL、咖啡酸0.141 2 mg/mL的對照品溶液，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取還陽參藥材粉末（過5 號篩）1.5 g，加70% 甲醇15 mL，超聲（300 W、40 kHz）提取30 min，靜置冷卻，再用70%甲醇補足減失質量，過濾，用0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 取還陽參藥材（S1），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下連續進樣6 次，測得各色譜峰相對保留時間和峰面積RSD 均小于0.7%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩定性試驗 取還陽參藥材（S1），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下，分別于0、2、4、8、12、24 h 進樣，測得各色譜峰相對保留時間和峰面積RSD 均小于2.0%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.3.3 重復性試驗 取還陽參藥材（S1）6 份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣，測得各峰的相對保留時間和峰面積的RSD 均小于3.0%，表明該方法重復性良好。

2.4 指紋圖譜建立

2.4.1 指紋圖譜建立 綠原酸和咖啡酸對照品按“2.2.1”項下方法制備對照品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣，得到綠原酸和咖啡酸對照品液相色譜圖，見圖1。按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣，得色譜圖，將10 批樣品色譜圖導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”（2008A 版），S6 為參照圖譜，采用中位數、時間窗為0.2 的方法，得到10 批樣品指紋圖譜見圖2，及對照指紋圖譜，見圖3，確定18 個共有峰。

圖2 10 批樣品UPLC 指紋圖譜

圖3 還陽參對照指紋圖譜

2.4.2 相似度分析 通過與對照品溶液色譜圖比對，確認5 號峰為綠原酸，6 號峰為咖啡酸。因5 號峰在各樣品中均存在，且含有量較高，分離度較好，故選取其為參照峰（S），計算得到18 個共有色譜峰的相對保留時間和相對峰面積見表2～3。采用“色譜指紋圖譜相似度評價系統2008A 版”軟件計算10 批樣品和對照指紋圖譜之間的相似度，分別為0.970、0.996、0.996、0.995、0.996、0.997、0.998、0.998、0.998、0.988，均在0.970 以上，表明10批還陽參質量相對穩定。

2.5 化學計量學分析 相似度評價難以看出10 批藥材之間的差異，需要進一步采用聚類分析和主成分分析明確藥材的差異，更好的評價10 批還陽參藥材質量。

2.5.1 聚類分析 將10 批樣品18 個共有峰面積導入SPSS23.0 版軟件，然后標準化處理進行聚類分析，得到10×18階數據矩陣，以組間平均鏈鎖距離及歐氏距離平方作為樣品測度。結果見圖4。

表2 10 批樣品共有峰相對保留時間

表3 10 批樣品共有峰相對峰面積

結果顯示，當判別條件距離為15 時，10 批樣品被分為4 大類，第1 類包括S2、S3、S4、S5、S7、S8；第2 類包括S9、S10；第3 類包括S6；第4 類包括S1。當判別條件距離為20 時，10 批樣品被分為2 大類，1 類包括S1；剩下的為另1 類。結果表明，分類情況與產地無關，可能是由于化學成分含有量差異導致。結果與相似度分析結果基本一致。

2.5.2 主成分分析 將18 個共有峰峰面積導入SPSS 23.0軟件，然后對其進行標準化處理，將處理后的共有峰峰面積進行主成分分析，相關矩陣的特征值及其方差見表4，結果見圖5～6，前4 個主成分的累計方差貢獻率為89.614%。

表4 主成分的初始特征值和累積貢獻率

圖4 10 批樣品聚類樹狀圖

由表5 可得，中藥化學成分眾多，多成分相互作用才是影響還陽參藥材質量差異的重要原因。4、7、11、12、15、17 號色譜峰對第一主成分的作用在0.7 以上，是影響第一主成分的主要來源；1、2、9、10、14 號色譜峰對第二主成分的作用在0.7 以上，是影響第二主成分的主要來源；5、8 號色譜峰對第三主成分的作用在0.8 以上，是影響第三主成分的主要來源；第4 主成分主要來自色譜峰10 的信息。

表5 初始因子載荷矩陣

將10 批還陽參藥材中18 個共有峰的峰面積導入SIMCA-P13.0 統計軟件進行PCA 分析，得到PCA 得分圖（圖5）、各成分柱狀圖（圖6）。

圖5 可直觀看到10 批還陽參藥材質量的差異，藥材1與其他樣本距離較遠，3、4、5 距離較近，6、7、8 距離較近，分類結果與HCA 結果基本一致。PCA 結果與HCA 的結果可以相互驗證。

圖6 代表各個色譜峰對還陽參藥材質量差異的貢獻值，其中9 號峰貢獻值最大、依次類推2、14、10、6、5 號色譜峰貢獻值較大。可以認為這6 個色譜峰是影響還陽參藥材質量差異的主要色譜峰，經對照品指認，5、6 號峰分別為綠原酸和咖啡酸，剩余色譜峰還需結合核磁、液質聯用等技術手段進一步鑒別確認。

圖5 10 批樣品主成分分析圖

圖6 各成分柱狀圖

3 討論

3.1 提取方法和色譜條件考察 參考文獻［14］，本實驗對提取溶劑、提取方法、提取次數及提取時間進行考察，以色譜峰數目、分離度、基線平穩程度為主要考慮因素，發現70%甲醇超聲提取30 min，提取1 次，提取率較好，雜質干擾少。

考察了流動相乙腈、甲醇、0.1%甲酸、0.1%乙酸、0.1%磷酸，柱溫25、26、27、28、29、30 ℃，波 長210、254、329 nm，最終確定“2.1”項下條件，此條件下基線平穩，色譜峰出峰時間合適，色譜峰個數較多，分離效果較好。

3.2 指紋圖譜建立 建立了10 批樣品UPLC 指紋圖譜，共標定了18 個共有峰，以對照指紋圖譜為參照，計算相似度，結果顯示10 批還陽參藥材相似度均大于0.970，表明10 批樣品質量相對穩定。且共有峰保留時間相差較小，但峰面積相差較大，表明不同批還陽參化學成分含有量差異較大［15-16］。

3.3 化學模式識別 以5 號峰綠原酸為參照峰，對其進行標準化處理，進行聚類分析和主成分分析。當判別條件距離為20 時，10 批樣品被分為2 類，結果表明，分類情況與產地無關，可能是由于化學成分含有量差異導致。主成分分析圖顯示S1 與其他批次樣品相距較遠，圖6 顯示，影響還陽參藥材質量差異的主要有6 個色譜峰。聚類分析、主成分分析及相似度結果基本一致，表明本實驗建立的還陽參藥材指紋圖譜具有可靠性。

本實驗首次建立了還陽參UPLC 指紋圖譜，較全面地反映了還陽參藥材化學成分的數目和含有量情況。結合相似度評價、聚類分析和主成分分析共同區分10 批樣品，綜合評價其指紋圖譜，試圖找到影響其質量差異的指標成分，為建立更加合理的還陽參質量標準提供科學依據。