LC-AFS 法測定靈芝孢子粉中4 種砷形態

林輝煥，蔡展帆，章錦涵，張佩霞，熊 欣，周憶蓮，梁旭霞

（廣東省食品檢驗所，廣東 廣州 510435）

砷是一種廣泛存在于自然界、與人類生活密切相關、在水和食物中常見的非金屬元素［1］，其常見形態有亞砷酸［As（III）］、砷酸［As（V）］、一甲基砷酸（MMA）、二甲基砷酸（DMA）砷膽堿（AsC）、砷甜菜堿（AsB）等，對人體的毒害作用依次減弱［2-3］，被認為與免疫系統功能性障礙、癌癥、皮膚病、心血管疾病等相關聯［4-5］。無機砷及其化合物已被確認為一類致癌物質［6-7］，其毒性與元素存在形態密切相關，故確定各種砷形態的含有量來評價被測試物的毒性更科學［8］。

靈芝孢子粉具有靈芝的全部遺傳物質和保健作用，其藥用價值日益受到重視，具有增強機體免疫力、抑制腫瘤、修復肝損傷、防護輻射損害等作用［9-12］，具有很大的藥用價值。但目前各國對中草藥的進出口控制均以總砷含有量限值作為指標，影響了其推廣應用，故分析市售靈芝孢子粉中的砷及其形態，特別是高毒性的無機砷含有量，對正確評估其安全性具有非常重要的意義。

目前，砷形態分析方法主要采用液相色譜、電感耦合等離子體質譜儀或原子熒光光譜儀測定的聯用技術［13-16］。本實驗采用我國自主研發的原子熒光光譜儀與液相色譜聯用（LC-AFS）技術考察靈芝孢子粉中的砷形態，以期為其質量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Elspe-2 元素形態分析儀（廣州譜臨晟儀器有限公司）；AFS-8230 原子熒光光度計（北京吉天儀器有限公司）；DHG-9145A 型電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；KQ-500DE 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Allegra 64R 臺式冷凍離心機（美國Beckman 公司），HQlld 數顯PH 計（美國Hach 公司）。PRPX-100 陰離子交換柱（瑞士Hamilton 公司）；OWT203陰離子交換色譜柱（廣州譜臨晟科技有限公司）。

2 方法與結果

2.1 LC-AFS 條件

2.1.1 元素形態分析儀 分離柱Hamilton PRPX-100 陰離子交換柱（250 mm×4.1 mm，10 μm）；保護柱Hamilton PRPX-100 陰離子交換柱（10 mm×4.1 mm，10 μm）；流動相15 mmol/L磷酸二氫銨（pH6.0）；體積流量1.2 mL/min；進樣量100 μL。

2.1.2 原子熒光光譜儀 負高壓270 V；As 燈電流60 mA；載氣高純氬氣；載流5% 鹽酸；還原劑0.5% 氫氧化鉀/1.5%硼氫化鉀溶液。

2.2 標準溶液制備 精密稱取一甲基砷、二甲基砷、三價砷、五價砷適量，分別置于100 mL 量瓶中，1% 硝酸稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液（1 mg/L），各精密量取適量，置于同一100 mL 量瓶中，水稀釋至刻度，搖勻，即得（1.0、5.0、10.0、15.0、20.0、50.0 μg/L）。

2.3 色譜柱篩選 本實驗考察Hamilton PRPX-100、譜臨晟OWT203 陰離子交換柱對4 種砷形態的分離效果，結果見圖1。由此可知，2 種型號色譜柱均能較好分離砷形態，但出峰順序有所不同，可能與兩者所使用柱填料不同造成的；OWT203 柱分離時間較短，310 s 內即能完全洗脫出來，而Hamilton PRPX-100 柱需要420 s，但后者峰型較好，沒有拖尾現象，出峰受提取溶劑的影響較小。因此，選擇Hamilton PRPX-100 陰離子交換柱進行實驗。

圖1 各砷形態色譜圖

2.4 樣品前處理

2.4.1 提取方式、提取溶劑篩選 本實驗選取總砷含有量較高（0.37 mg/kg）的市售靈芝孢子粉，分別在90 ℃加熱、常溫超聲條件下考察1%硝酸、1%乙酸、1%鹽酸、超純水對4 種砷形態的提取效果，結果見圖2。由此可知，90 ℃加熱時的提取效率優于常溫超聲，并且以1% 硝酸為溶劑時提取率最高，達77.4%（以無機砷為主），其次是1%鹽酸；在常溫超聲時，1% 鹽酸提取效率最高，其次是1%乙酸。

圖2 提取方式、提取溶劑對4 種砷形態提取效果的影響

2.4.2 提取時間篩選 根據“2.4.1”項下結果，本實驗分別選擇在90 ℃加熱時提取效率最高的1%硝酸，以及在常溫超聲時提取效率最高的1% 鹽酸，考察提取時間1、1.5、2、2.5 h 對4 種砷形態提取率的影響，結果見圖3。由此可知，在90 ℃加熱時提取率隨著時間延長而升高，在2 h 時達到最大值（78%），2.5 h 后基本不變；在常溫超聲時提取率隨著時間延長而有所波動，但整體上都不高，在30%～40%之間。

圖3 提取時間對4 種砷形態提取效果的影響

2.4.3 處理方法 取適量孢子粉（膠囊去除外殼），混勻后稱取0.5 g，置于15 mL 離心管中，加入10 mL 1%硝酸，置于90 ℃烘箱中放置2 h，每隔15 min 取出振搖1 次，提取完成后取出，冷卻至室溫，8 000 r/min 離心5 min，倒出上清液并加入10 mL 正己烷，振搖充分以除去脂肪，8 000 r/min離心10 min，注射器吸取部分下層清液，0.45 μm微孔濾膜過濾。取濾液過C18小柱（先用10 mL 甲醇過濾，再用20 mL 超純水過濾，活化靜止30 min），收集續濾液，過2 μm 濾膜，上機分析。

2.5 方法學考察

2.5.1 線性關系考察 按“2.2”項下方法制備標準溶液，在“2.1”項條件下進樣測定。以溶液質量溶度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，結果見表1，可知各砷形態在各自范圍內線性關系良好。

配制系列低質量濃度（0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 μg/L）的混標溶液，在“2.1”項條件下進樣測定，根據信噪比（S/N）≥3 確定檢出限。結果，各砷形態在0.2 μg/L 下時S/N 仍大于3，說明檢出限是低于0.2 μg/L的。

表1 各砷形態線性關系

2.5.2 精密度試驗 取市售樣品，加入低、中、高質量濃度標準溶液，平行6 份，在“2.1”項條件下進樣測定，結果見表2，可知RSD 均小于7%，表明儀器精密度良好。

表2 各砷形態精密度試驗結果（n=6）

2.5.3 加樣回收率試驗 取市售樣品進行加樣回收率試驗，平行3 次，結果見表3。由此可知，相對于As5+，As3+回收率整體上較高，可能是因為兩者會互相轉化，但無機砷總量回收率在合理范圍內。

表3 各砷形態加樣回收率試驗結果（n=3）

2.6 樣品含有量測定 取6 種樣品，按上述優化條件進行分析，計算含有量，結果見表4。由此可知，砷形態以無機砷為主，DMA、MMA 僅分別在1 種樣品中被檢測出，其中有3 種無機砷含有量達到或略高于食品安全國家標準GB 2762—2017 《食品中污染物限量》中的稻谷、糙米、大米限量（0.2 mg/kg），但低于GB 16740—2014《食品安全國家標準 保健食品》總砷限量（1.0 mg/kg）。

3 討論

本實驗確定靈芝孢子粉最優提取方法為樣品加入1%硝酸，在90 ℃下加熱提取2 h（每隔15 min 振搖1 次）。在應用LC-AFS 法分析其中4 種砷形態時，以15 mmol/L 磷酸二氫銨（pH6.0）為流動相等度洗脫，可保證結果準確性，僅8 min 即可完成檢測，而且該方法具有檢測成本低、靈敏度高、檢出限低等優點。

表4 各砷形態含有量測定結果

靈芝孢子粉服用劑量為6～8 g/d，本實驗測得其中無機砷最高質量分數為0.381 mg/kg，即每天攝入量為2.28～3.04 μg。聯合國糧農組織和世界衛生組織下的食品添加劑聯合專家委員會（JECFA）暫定，無機砷的可耐受攝入量為每天2.14 μg/kg，即成年人（體質量60 kg）每天允許攝入128.4 μg。由此可知，靈芝孢子粉中無機砷含有量在可接受暴露量范圍內。

另外，以總砷含有量為指標來衡定藥用砷暴露量時，會夸大無機砷暴露量。因此，有必要建立藥用靈芝孢子粉中無機砷的提取和測定方法，以完善砷毒性評價手段，有效規范市售藥粉質量，從而保障服用者的健康。