一測(cè)多評(píng)法測(cè)定古羊藤中3 種成分

盧森華，甘洋縈，陸玉丹，楊桂林，林 瑤，曾海生*

（1.玉林市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，廣西 玉林 537000；2.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣西 百色 533000；3.右江民族醫(yī)學(xué)院，廣西 百色 533000）

古羊藤Streptocaulon griffithiiHook 為蘿藦科馬蓮鞍屬藤本植物，以根入藥，又名馬蓮鞍、藤苦參等［1］。具有清熱解毒、散瘀止痛的功效，主要用于治療濕熱腹瀉、心胃氣痛、感冒發(fā)熱、跌打損傷等癥［2］，是2015 年版《中國(guó)藥典》收載的傣藥“雅叫哈頓散”中的主治藥之一［3］，具有較高的藥用價(jià)值。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明古羊藤有多種潛在的抗腫瘤、抑菌、抗病毒等活性［4-6］。古羊藤化學(xué)成分復(fù)雜，從該植物中已分離鑒別出強(qiáng)心苷類、萜類和酚酸類等成分［7-10］，其中強(qiáng)心苷是古羊藤發(fā)揮其抗腫瘤作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ)［4］，酚酸類化合物有較廣泛的抑菌、抗病毒活性［11］。關(guān)于古羊藤藥材的現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，僅有廣西和貴州的地方中藥材標(biāo)準(zhǔn)收載［1］，并且過于簡(jiǎn)單，僅有性狀描述，無含有量測(cè)定項(xiàng)，無法有效控制其質(zhì)量［12］。含有量測(cè)定是控制中藥質(zhì)量的有效手段，羅宇東等［13］采用UV 法測(cè)定古羊藤中有效成分的含有量，但當(dāng)前國(guó)內(nèi)外尚無采用一測(cè)多評(píng)法測(cè)定其含有量的報(bào)道。一測(cè)多評(píng)法（QAMS）基于多指標(biāo)質(zhì)量控制的研究思路，成為中藥及其制劑質(zhì)量評(píng)價(jià)的新模式［14］。本實(shí)驗(yàn)建立一測(cè)多評(píng)法測(cè)定古羊藤中綠原酸、咖啡酸、4-甲氧基水楊醛的含有量，以期為有效評(píng)價(jià)和控制古羊藤藥材質(zhì)量提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 1260 Infinity 型高效液相色譜儀（配置G1311C 型四元泵、G1329B 型進(jìn)樣器、G1 316 A型柱溫箱、G1315D 型檢測(cè)器，美國(guó)安捷倫公司）；UltiMate3000 型高效液相色譜儀（配置 HPG-3400SD 四元泵、WPS-3000TSL 進(jìn)樣器、TCC-300SD 柱溫箱、DAD-3000RS 檢測(cè)器，美國(guó)賽默飛世爾公司）；XS-205Du 型電子分析天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］；KQ-500GDV 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；501型超級(jí)恒溫水浴鍋（金壇市醫(yī)療儀器廠）；Synergy?UV 型超純水機(jī)（美國(guó)密理博公司）。

1.2 試劑與藥物 古羊藤藥材采自廣西各地，藥材來源主要是采購(gòu)和野外采集，信息見表1，經(jīng)玉林市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心中藥室黎小偉主任中藥師鑒定為正品，符合1990 年版《廣西中藥材標(biāo)準(zhǔn)》項(xiàng)下規(guī)定。綠原酸（110753-201415，純度96.2%）、咖啡酸（110885-200102，純度100%）、4-甲氧基水楊醛（110790-201404，純度99.0%）對(duì)照品均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。乙腈、甲醇（色譜純，德國(guó)默克公司）；磷酸（優(yōu)級(jí)純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）；水為超純水，其他所用試劑均為分析純。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6×150 mm，5μm）；流動(dòng)相甲醇（A）-0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～5 min，15.0%A；5～40 min，15.0%～70.0%A）；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；波長(zhǎng)230 nm；進(jìn)樣量5 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 精密稱取綠原酸對(duì)照品11.60 mg、咖啡酸對(duì)照品6.72 mg、4-甲氧基水楊醛對(duì)照品11.66 mg，分別置于不同的25 mL 量瓶中，加適量甲醇超聲（500 W，40 kHz）使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得單一對(duì)照品溶液。再分別精密量取上述綠原酸溶液2.0 mL、咖啡酸溶液1.0 mL、4-甲氧基水楊醛溶液0.4 mL，置于同一10 mL 量瓶中并用甲醇定容，即得混合對(duì)照品溶液。（每1 mL 混合對(duì)照品溶液含綠原酸89.27 μg、咖啡酸26.90 μg、4-甲氧基水楊醛18.47 μg）。

2.2.2 供試品溶液 取古羊藤樣品約2 g，精密稱定，置于100 mL 錐形瓶中，精密加入80% 甲醇25.0 mL，稱定質(zhì)量，超聲（500 W，40 kHz）提取30 min，放冷，用80%甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，溶液過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 系統(tǒng)適應(yīng)性與專屬性試驗(yàn) 分別精密吸取混合對(duì)照品溶液與供試品溶液各5 μL，在“2.1”項(xiàng)條件下測(cè)定，供試品中相應(yīng)的色譜峰與綠原酸、咖啡酸、4-甲氧基水楊醛對(duì)照品色譜峰保留時(shí)間、原始紫外光譜和一階導(dǎo)數(shù)光譜一致，并與其他共存成分的分離度大于1.5，理論塔板數(shù)均大于5 000。色譜圖見圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.3.2 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.6、2.0 mL，分別置2.0 mL 量瓶中，加80% 甲醇定容至刻度，搖勻，制成系列混合對(duì)照品溶液，在“2.1”項(xiàng)條件下分別進(jìn)樣5 μL，以目標(biāo)峰峰面積為縱坐標(biāo)（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），進(jìn)行回歸，結(jié)果見表2。表明各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下同一供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次，測(cè)得綠原酸、咖啡酸、4-甲基氧水楊醛峰面積RSD 分別為1.3%、1.4%、1.4%，表明儀器精密度良好。

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取S1 號(hào)古羊藤樣品6 份，每份2 g，精密測(cè)定，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)條件下分別進(jìn)樣5 μL，測(cè)得綠原酸、咖啡酸、4-甲氧基水楊醛含有量RSD 分別為4.8%、2.6%、1.8%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下同一供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)條件下，分別于1、2、4、6、12、24 h 進(jìn)樣，測(cè)得綠原酸、咖啡酸、4-甲基氧水楊醛含有量 RSD 分別為0.4%、1.1%、0.1%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 取已測(cè)定含有量的S1號(hào)古羊藤樣品6 份，每份約1 g，精密稱定，另精密稱取綠原酸對(duì)照品6.90 mg、咖啡酸對(duì)照品2.37 mg、4-甲氧基水楊醛對(duì)照品2.03 mg，置500 mL量瓶中，加適量80% 甲醇超聲使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照品貯備液。分別在上述6 份樣品中精密加入混合對(duì)照品貯備液25 mL，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品品溶液，在“2.1”項(xiàng)條件下分別進(jìn)樣5 μL，記錄各成分峰面積并計(jì)算回收率，結(jié)果見表3。

表3 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.3 Results of recovery tests for various constituents（n=6）

2.4 相對(duì)校正因子計(jì)算 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，依法測(cè)定綠原酸、咖啡酸、4-甲基氧水楊醛的峰面積，以綠原酸為內(nèi)標(biāo)，按公式fsi＝fs/fi＝（As/Cs）/（Ai/Ci），其中As綠原酸內(nèi)標(biāo)峰面積，Cs為綠原酸內(nèi)標(biāo)物濃度，Ai為待測(cè)成分咖啡酸或4-甲基氧水楊醛峰面積，Ci為待測(cè)成分咖啡酸或4-甲基氧水楊醛濃度）計(jì)算相對(duì)校正因子。結(jié)果顯示咖啡酸、4-甲氧基水楊醛相對(duì)校正因子分別為 0.504、0.460，RSD 分別為 0.4%、0.3%，結(jié)果見表4。

2.5 系統(tǒng)耐用性考察

2.5.1 進(jìn)樣量 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，在“2.1”項(xiàng)條件下分別進(jìn)樣4、5、6 μL，考察不同進(jìn)樣體積對(duì)相對(duì)校正因子的影響。結(jié)果見表5，結(jié)果顯示，不同進(jìn)樣體積對(duì)相對(duì)校正因子影響程度不明顯，咖啡酸、4-甲氧基水楊醛相對(duì)校正因子RSD 分別為0.1%、0.09%，相對(duì)保留時(shí)間RSD 分別為0.03%、0.1%。

表4 各成分相對(duì)校正因子Tab.4 Relative correction factors of various constituents

表5 不同進(jìn)樣量的相對(duì)校正因子Tab.5 Relative correction factors of different injection volumes

2.5.2 儀器和色譜柱 選擇Agilent 1260 和Ulti-Mate3000 高效液相色譜儀，以及Atlantis?T3（4.6 mm×250 mm，5 μm）、ZORBAX SB C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Eclipse Plus C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，考察不同儀器、不同色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響。結(jié)果見表6，結(jié)果顯示，不同儀器、不同色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子影響程度在可接受范圍內(nèi)，咖啡酸、4-甲氧基水楊醛相對(duì)校正因子RSD 分別為2.3%、3.5%。

表6 不同儀器和色譜柱上相對(duì)校正因子Tab.6 Relative correction factors on different instruments and columns

2.5.3 體積流量 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液5 μL，在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，考察0.9、1.0、1.1 mL/min 3 個(gè)不同體積流量對(duì)相對(duì)校正因子的影響。結(jié)果見表7，結(jié)果顯示，不同體積流量對(duì)相對(duì)校正因子影響程度不明顯，咖啡酸、4-甲氧基水楊醛相對(duì)校正因子RSD 分別為0.4%、0.1%，相對(duì)保留時(shí)間RSD 分別為0.06%、1.0%。

2.5.4 柱溫 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液5 μL，在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，考察20、25、30 ℃3 個(gè)不同柱溫對(duì)相對(duì)校正因子的影響。結(jié)果見表8，結(jié)果顯示，不同柱溫對(duì)相對(duì)校正因子影響程度不明顯，咖啡酸、4-甲氧基水楊醛相對(duì)校正因子RSD 分別為0.5%、1.3%，相對(duì)保留時(shí)間RSD 分別為0.1%、4.6%。

表7 不同體積流量的相對(duì)校正因子Tab.7 Relative correction factors of different volume flow rate

表8 不同柱溫的相對(duì)校正因子Tab.8 Relative correction factors of different column temperature

2.5.5 波長(zhǎng) 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液5 μL，在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，考察228、230、232 nm 3 個(gè)不同測(cè)定波長(zhǎng)對(duì)相對(duì)校正因子的影響。結(jié)果見表9，結(jié)果顯示，不同測(cè)定波長(zhǎng)對(duì)相對(duì)校正因子影響程度不明顯，咖啡酸、4-甲氧基水楊醛相對(duì)校正因子RSD 分別為1.4%、2.4%，相對(duì)保留時(shí)間RSD 均為0。

表9 不同測(cè)定波長(zhǎng)的相對(duì)校正因子Tab.9 Relative correction factors of different measuring wavelengths

2.6 色譜峰定位 分別考察相對(duì)保留時(shí)間在不同儀器、色譜柱中的重復(fù)性。結(jié)果見表10，結(jié)果顯示，不同測(cè)定波長(zhǎng)對(duì)相對(duì)保留時(shí)間影響程度不明顯，RSD 分別為0.5%、9.4%，故選擇綠原酸作為色譜峰定位指標(biāo)。

2.7 樣品含有量測(cè)定 經(jīng)方法學(xué)優(yōu)化和考察后，采用以上建立的QAMS 法，對(duì)11 批樣品中咖啡酸、4-甲基氧水楊醛的含有量進(jìn)行測(cè)定，為了考察QAMS 法的準(zhǔn)確性［15］，把QAMS 的測(cè)定結(jié)果與外標(biāo)法（ESM）測(cè)定結(jié)果進(jìn)行了比較。表明所建立的方法具有較好的可信度，結(jié)果見表11。

表10 不同儀器和色譜柱上相對(duì)保留時(shí)間Tab.10 Relative retention time on different instruments and columns

表11 各成分含有量測(cè)定結(jié)果（μg/g）Tab.11 Results of content determination of various constituents（μg/g）

3 討論

本實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)［16-18］，分別考察了提取方法（加熱回流和超聲）、提取溶劑（30%、50%、70%、80%、100% 甲醇）、料液比（15、25、50、100 mL）、提取時(shí)間（30、45、60、90、120 min），發(fā)現(xiàn)用80%甲醇超聲提取30 min 后所得的峰基線平穩(wěn)，色譜圖中檢測(cè)成分較多且峰形較好。本實(shí)驗(yàn)還考察了流動(dòng)相、色譜柱、柱溫、進(jìn)樣量對(duì)古羊藤樣品溶液分離效果的影響［16-17］。確定“2.1”項(xiàng)下條件。

傳統(tǒng)中醫(yī)的整體觀要求對(duì)中藥材進(jìn)行多藥效成分指標(biāo)的綜合評(píng)價(jià)［18］。為了確保質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中定量指標(biāo)的正確，通過采用保留時(shí)間定性、紫外光譜和一階導(dǎo)數(shù)光譜匹配等方法確證了綠原酸、咖啡酸、4-甲氧基水楊醛存在于古羊藤中。并且綠原酸為古羊藤的重要質(zhì)量標(biāo)志物，因此以綠原酸為內(nèi)標(biāo)，建立一測(cè)多評(píng)法測(cè)定古羊藤中綠原酸、咖啡酸、4-甲氧基水楊醛的含有量。本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了該方法的精密度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性、系統(tǒng)適應(yīng)性和一測(cè)多評(píng)法的準(zhǔn)確性，并對(duì)一測(cè)多評(píng)法的適用性和可行性進(jìn)行探討。結(jié)果表明，一測(cè)多評(píng)法推算的含有量與外標(biāo)法所得含有量沒有顯著性差異，表明實(shí)驗(yàn)建立的相對(duì)校正因子具有較好的可信度［19］。

隨著一測(cè)多評(píng)法在《中國(guó)藥典》中的應(yīng)用越來越廣泛［20］，本實(shí)驗(yàn)建立的一測(cè)多評(píng)方法可對(duì)古羊藤進(jìn)行多藥效成分指標(biāo)的綜合評(píng)價(jià)，以期為建立科學(xué)合理的古羊藤質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，提高其質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供參考。