生脈注射液中4 種成分測定及HPLC 特征圖譜建立

梁 悅 劉 濤 李松洋 葉 萌 王 晨 吳 磊

（1.四川省中醫藥科學院， 四川 成都 610041； 2.成都大學， 四川 成都 610106）

生脈注射液現行標準收載于衛生部藥品標準中藥成方制劑第十五冊（WS3-B-2865-98-2011），但其中規定的指紋圖譜方法所得色譜峰1、2、3、7、8、9、10、15、16 均未達到基線分離，尚有待進一步提升；對色譜柱要求高（親水柱），導致在實際操作過程中增加了分析成本，不利于推廣使用；僅對紅參有效成分人參皂苷Rg1、Re、Rb1及五味子中五味子醇甲含有量進行了測定，尚未涉及其余類型人參皂苷、木脂素及麥冬有效成分。

一測多評法是指選取1 個內標，通過建立它與其他成分的相對校正因子來測定含有量，可很好地解決中藥成分分離難度大、單體不穩定、價格昂貴等問題，具有檢測成本低、分析速度快等諸多優勢［1-5］。目前，該方法已在中藥行業中得到廣泛應用［6-9］，并收錄于2015 年版《中國藥典》，從2010年版的1 個品種增至9 個。

特征圖譜常通過HPLC、GC、LC-MS、GC-MS等手段建立，其中HPLC 特征圖譜具有可操作性強、分析速度快、分辨率高、重復性好等特點，目前己成為主流分析方法［10］，既能完整表達中藥整體物質信息及特征，又可對其質量進行全面評價［11-12］。但該技術也存在一些缺陷，例如它作為定性控制方法具有一定模糊性，不能對所有特征峰進行定量分析；在結果分析方面采用相似度評價模式，峰面積較大的色譜峰對其影響較明顯，而較小的難以得到體現。

本實驗首先建立一測多評法同時測定生脈注射液中人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、五味子醇甲、麥冬皂苷C 的含有量，并在此基礎上建立HPLC 特征圖譜進行質量控制［13-15］，兩者聯用既能全面控制該制劑質量，又能對每個共有峰進行定量分析，從而為其質量標準建立提供參考。

1 材料

Waters 2695 高效液相色譜儀［沃特世科技（上海）有限公司］；SQP 電子分析天平［十萬分之一，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司］。人參皂苷Rg1（批號150924，純度≥98%）、人參皂苷Rb1（批號16060402，純度≥98%）、五味子醇甲（批號110857-200405，純度≥98%）、麥冬皂苷C（批號180411-047，純度≥98%）對照品均購自四川省維克奇生物科技有限公司。生脈注射液來自4 個廠家，共17 批（編號1～17），每支10 mL。

2 方法與結果

2.1 一測多評法建立

2.1.1 色譜條件 Supersil ODS2 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）-水（B），梯度洗脫，程序見表1；體積流量1 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長203 nm；進樣量10 μL，色譜圖見圖1。由此可知，各成分分離度良好。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution programs

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.1.2 對照品溶液制備 精密稱取人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、五味子醇甲、麥冬皂苷C 對照品適量，甲醇制成每1 mL 分別含四者1.027、1.074、0.247、1.101 mg 的溶液，即得。

2.1.3 供試品溶液制備 取注射液適量，0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.1.4 相對校正因子測定 以人參皂苷Rb1為內標，計算其他3 種成分的相對校正因子fk/s，公式為fk/s＝fk/fs＝（CkAs）/（CsAk），其中Ck為其他成分質量濃度，Ak為其他成分峰面積，Cs為內標質量濃度，As為內標峰面積，結果見表2。

表2 各成分相對校正因子Tab.2 Relative correction factors of various constituents

2.1.5 方法學考察

2.1.5.1 線性關系考察 精密吸取“2.1.2”項下對照品溶液適量，依次稀釋2.5、4、6.25、10、20 倍，作為線性溶液A～E，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定。以溶液質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，結果見表3，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。以S/N＝10為定量限，測得人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、五味子醇甲、麥冬皂苷C 定量限分別為9.1、13.2、6.2、17.5 ng。

表3 各成分線性關系Tab.3 Linear relationships of various constituents

2.1.5.2 精密度試驗 取“2.1.5.1”項下線性溶液A，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定6 次，測得人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、五味子醇甲、麥冬皂苷C 峰面積RSD 分別為0.16%、0.21%、0.10%、0.32%，表明儀器精密度良好。

2.1.5.3 重復性試驗 取注射液（廠家D，批號170504）適量，按“2.1.3”項下方法制備6 份供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、五味子醇甲、麥冬皂苷C 峰面積RSD 分別為0.38%、0.41%、0.62%、0.65%，表明該方法重復性良好。

2.1.5.4 穩定性試驗 取注射液（廠家D，批號170504）適量，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，于0、2、4、6、8、12、24 h 在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、五味子醇甲、麥冬皂苷C 峰面積RSD分別為0.16%、0.22%、0.28%、0.59%，表明溶液在24 h 內穩定性良好。

2.1.5.5 加樣回收率試驗 精密量取各成分含有量已知的注射液（廠家D，批號170504）0.5 mL，共6 份，按1∶1 比例加入對照品溶液，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率，結果見表4。

表4 各成分加樣回收率試驗結果（n=6）Tab.4 Results of recovery tests for various constituents（n=6）

2.1.5.6 耐用性試驗 考察不同柱溫、體積流量、色譜柱、儀器對相對校正因子的影響，結果見表5～8，可知均無明顯影響（RSD＜5.0%）。

表5 不同柱溫對相對校正因子的影響Tab.5 Effects of different column temperatures on relative correction factors

表6 不同體積流量對相對校正因子的影響Tab.6 Effects of different volumetric flow rates on relative correction factors

表7 不同色譜柱對相對校正因子的影響Tab.7 Effects of different columns on relative correction factors

表8 不同儀器對相對校正因子的影響Tab.8 Effects of different instruments on relative correction factors

2.1.6 色譜峰定位 以人參皂苷Rb1為內標，測定其他3 種成分在不同儀器、色譜柱下的的相對保留時間，結果見表9，可知均無明顯影響（RSD＜5.0%）。

表9 各成分相對保留時間Tab.9 Relative retention time of various constituents

2.1.7 樣品含有量測定 精密吸取供試品溶液10 μL，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，分別采用外標法、一測多評法計算含有量，結果見表10，可知2 種方法所得結果無明顯差異（RSD＜5.0%）。

表10 各成分含有量測定結果（μg/mL）Tab.10 Results of content determination of various constituents（μg/mL）

2.2 HPLC 特征圖譜建立 采用國家藥典委員會相似度評價軟件（2004 版）建立注射液對照特征圖譜，見圖3，與現行標準（WS3-B-2865-98-2011）比較，其色譜峰分離情況更理想。再對17批樣品進行特征圖譜采集，見圖4，發現了8 個共有峰，以3 號峰（人參皂苷Rb1）為參照，測定其他共有峰的相對保留時間、相對峰面積，以兩者平均值的±20%為范圍，結果見表11。

圖3 生脈注射液對照特征圖譜Fig.3 Reference characteristic chromatogram of Shengmai Injection

3 討論與結論

中成藥成分復雜，尤其是復方制劑，其種類更為繁多，作用機制也更為復雜。藥理研究表明，中成藥不是某種單一成分發揮作用，而是多種成分同時作用在同一或不同靶點來發揮療效，因此研究單一或個別幾種成分難以全面準確地對其進行綜合評價［16-17］，而特征圖譜的引入很好地解決了這一問題。

圖4 17 批樣品HPLC 特征圖譜Fig.4 HPLC characteristic chromatograms of seventeen batches of samples

表11 各共有峰相對保留時間、相對峰面積Tab.11 Relative retention time and relative peak areas of various common peaks

本實驗中一測多評考察部分均按照王智民研究員課題組提出的“一測多評法建立的技術指南”進行［18］，并且認為在方法學考察時除了按照指南對分析方法、供試品制備方法等進行驗證外，還應關注校正因子以驗證其準確性。以人參皂苷Rb1為內標時，能同時測定人參皂苷Rg1、五味子醇甲、麥冬皂苷C 的含有量，從而對生脈注射液中各藥材質量進行控制，并且在該色譜條件下各色譜峰分離情況良好，解決了現行標準檢測分析成本高、誤差大（選定的多個共有峰均未達到基線分離）的問題。另外，目前在指紋/特征圖譜的定性研究中以相似度為評價指標，可控性不強，故本實驗采用相對保留時間、相對峰面積對各共有峰進行控制，并規定了兩者范圍，能從整體上控制產品質量。

綜上所述，本實驗首次將一測多評法與HPLC特征圖譜相結合來控制參麥注射液質量，可充分發揮兩者優勢，對該制劑同時進行定性、定量控制，彌補了目前指紋/特征圖譜只能用于定性研究的不足。