藤茶總黃酮固體脂質納米?？垢伟┗钚约捌渌巹訉W研究

楊毛毛，羅花彩，徐 偉，林珠燦*，郭素華，沙 玫*

（1.福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 350122；2.福建中醫藥大學附屬人民醫院，福建 福州 350004）

肝癌為常見的惡性腫瘤之一，近年來其發病率呈上升趨勢，嚴重威脅人類健康［1-2］，但目前市場上的廣譜抗肝癌藥物往往會對人體免疫力、器官等造成不同程度的損害。前期報道，藤茶所含的黃酮在抗腫瘤方面效果明顯，并有潛力開發為抗肝癌輔助藥物［3-6］，但其主要成分二氫楊梅素（占總黃酮含有量的82%以上［7］）的結構中含3，5，7，3′，4′，5′-六酚羥基，易被氧化，而且體內消除快，口服吸收差，生物利用度低［8-9］，嚴重影響體內藥效和臨床應用，故需通過新型給藥系統來改善其穩定性和生物利用度。

固體脂質納米粒是一種具有比表面積大、無生物毒性、可控釋、靶向性良好、能降低不良反應等諸多優勢的載藥體系［10-11］，課題組前期已對藤茶總黃酮固體脂質納米粒制備工藝進行優化［12］。本實驗在此基礎上進一步考察該制劑的抗肝癌活性，并對主要成分二氫楊梅素的藥動學進行研究，以期為藤茶總黃酮及其新制劑的后續開發及臨床應用提供依據。

1 材料

電子天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］；Infinite200 PRO 多功能酶標儀（瑞士Tecan公司）；TS100 倒置顯微鏡（日本尼康公司）；Galaxy 170R 型CO2培養箱（瑞軒電子科技上海有限公司）；LCMS-8045 島津液質聯用儀（日本島津公司）。

藤茶總黃酮提取物及固體脂質納米粒均為課題組自制（二氫楊梅素質量濃度為40.15 mg/mL）。環磷酰胺（批號113842，商品名安道生）；順鉑（批號B1210L79601，鉑質量分數65%）；二氫楊梅素對照品（批號160422，純度≥98.0%，上海源葉生物科技有限公司）；二氫槲皮素對照品（批號BA09B006，純度＞98.0%，成都普思生物科技股份有限公司）；

鼠源性肝癌細胞（H22）、人肝癌細胞（HepG2）細胞株均由福建中醫藥大學藥學院陳莉課題組惠贈。清潔級ICR 雄性小鼠，體質量18～22 g；SD 雄性大鼠，體質量（220±20）g，均購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，動物生產許可證號分別為SCXK（滬）2017-0005、SCXK（滬）2017-0002。

2 方法

2.1 HepG2 細胞增殖抑制率測定 采用MTT法［6，13］。將對數生長期的HepG2 細胞用0.25% 胰蛋白酶消化，完全培養液（DMEM 高糖+10%胎牛血清+1%雙抗）配成單細胞懸液（5×104/mL）后接種于96 孔培養板（100 μL/孔）上，置于CO2培養箱中，在37 ℃、5% CO2條件下進行培養。待各孔中細胞完全貼壁后給藥，設置對照組、陽性藥（順鉑）組（0.5、1.0、2.5、5.0、25.0、50.0 μg/mL）、藤茶總黃酮組、藤茶總黃酮固體脂質納米粒組、空白納米粒組（5、10、25、50、100、200 μg/mL），每個質量濃度設5 個復孔（150 μL/孔），繼續在37 ℃、5% CO2條件下培養24、48、72 h 后，每孔加入5 mg/mL MTT 溶液10 μL，置于CO2培養箱中培養4 h 后終止，DMSO（100 μL/孔）溶解紫色結晶。酶標儀檢測每孔在490 nm 波長處的光密度（OD490），重復3 次，取平均值，計算增殖抑制率，公式為抑制率＝（1-給藥組OD490/對照組OD490）×100%。

2.2 體內抗肝癌活性研究

2.2.1 模型建立 參考文獻［14］報道。H22細胞復蘇后在小鼠腹腔中培養，傳2～3 代后在無菌條件下抽取腹水，生理鹽水洗滌后離心，重復3 次，PBS 緩沖液稀釋，0.2% 臺盼藍染色后當活細胞數大于95% 時，調整細胞濃度為5×106/mL，吸取濃度均勻的細胞懸液，以0.2 mL/只劑量皮下注射于小鼠右腋下。

2.2.2 分組與給藥 稱取藤茶總黃酮適量，加適量蒸餾水加熱溶解，分別制成低劑量（30 mg/mL）、高劑量（120 mg/mL）混懸液；藤茶總黃酮固體脂質納米粒冷凍干燥后，加適量蒸餾水均勻分散，分別制成低劑量（30 mg/mL）、高劑量（120 mg/mL）混懸液。

70 只小鼠適應性飼養5 d 后，隨機分為空白組，模型組，陽性藥組，藤茶總黃酮固體脂質納米粒高、低劑量組，藤茶總黃酮高、低劑量組，每組10 只，除空白組外各組小鼠均于右腋下接種H22細胞造模。根據預實驗結果，陽性藥組小鼠腹腔注射3 mg/kg 環磷酰胺（0.2 mL/10 g），空白組、模型組小鼠灌胃給予生理鹽水，藤茶總黃酮高、低劑量組，藤茶總黃酮固體脂質納米粒高、低劑量組均分別按2.4、0.6 g/kg 劑量灌胃給予相應含藥混懸液，各組小鼠每天給藥1 次，連續10 d。每天稱定小鼠體質量，觀察其活動、毛發色澤、死亡等情況。最后1 次給藥結束，小鼠禁食不禁水24 h 后處死，完整剝離腋窩皮下實體瘤，稱定質量，計算抑瘤率，同時剖取胸腺、脾臟后稱定質量，計算臟器指數，公式分別為抑瘤率＝（1-給藥組腫瘤質量/模型組腫瘤質量）×100%、胸腺（或脾臟）指數＝胸腺（或脾臟）質量/小鼠體質量。

2.3 藥動學研究

2.3.1 LC-MS/MS 條 件參考文獻［15-16］報道。

2.3.1.1 色譜 Shim-pack XR-ODS Ⅲ色譜柱（75 mm×2.0 mm，1.6 μm）；流動相0.1%甲酸-乙腈（85∶15）；體積流量0.3 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量1 μL。

2.3.1.2 質譜 負離子多級反應（MRM）模式；電噴霧離子源（ESI）；定量離子對，二氫楊梅素m/z319.15～193.20，二氫槲皮素m/z303.20～125.10；霧化氣體積流量3.0 L/min；干燥氣、加熱氣體積流量10.0 L/min；接口電壓3.0 kV；接口溫度 400 ℃；檢測器電壓 1.76 kV；CID 氣230 kPa。

2.3.2 分組及給藥 按“2.2.2”項下方法制備含藥混懸液，藤茶總黃酮質量濃度為7.5 mg/mL。大鼠適應性飼養5 d 后，隨機分為藤茶總黃酮組、藤茶總黃酮固體脂質納米粒組，每組6 只，于實驗前12 h 禁食，自由飲水，按150 mg/kg 劑量灌胃給藥，于0.167、0.33、0.5、0.667、1、2、3、4、6、8、12、24 h 眼眶靜脈叢釆血各0.5 mL，置于肝素鈉處理的EP 管中，靜置30 min，4 ℃下6 000 r/min離心15 min 分離血漿，-20 ℃下冷凍保存。

2.3.3 血漿樣品處理 精密吸取“2.3.2”項下血漿100 μL 于離心管中，加入內標（二氫槲皮素）溶液10 μL，渦旋30 s，加入1% 甲酸乙腈（蛋白沉淀劑）190 μL，渦旋5 min，4 ℃下17 000 r/min離心15 min，取上清液，0.22 μm 微孔濾膜過濾，在“2.3.1”項條件下進樣測定。

2.3.4 方法學考察

2.3.4.1 對照品、內標溶液制備 精密稱取二氫楊梅素對照品、內標（二氫槲皮素）適量，置于100 mL 量瓶中，乙腈溶解定容，即得（兩者質量濃度分別為50、30 μg/mL）。

2.3.4.2 專屬性考察 取“2.3.4.1”項下對照品、內標溶液，以及按“2.3.3”項下方法處理的空白血漿、含藥血漿樣品溶液，在“2.3.1”項條件下進樣測定，結果見圖1。

圖1 二氫楊梅素MRM 色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of dihydromyricetin

2.3.4.3 線性關系考察 精密吸取空白血漿90 μL，加入10 μL 對照品溶液，制成含二氫楊梅素1、5、10、20、50、100、200、500 ng/mL 的血漿樣品溶液，按 “2.3.3”項下方法處理，在“2.3.1”項條件下進樣測定。以溶液質量濃度為橫坐標（X），二氫楊梅素、內標峰面積比值為縱坐標（Y）進行回歸，得方程為Y＝0.004 3X-0.022 6（r＝0.999 6），在1～500 ng/mL 范圍內線性關系良好，定量限（S/N＝10）為1 ng/mL。

2.3.4.4 精密度、準確度試驗 制備含5、20、200 ng/mL 二氫楊梅素的血漿樣品溶液，各平行3份，按“2.3.3”項下方法處理，在“2.3.1”項條件下進樣測定，連續3 d，測得二氫楊梅素日內、日間精密度RSD 分別為0.25%～1.16%、0.67%～1.13%，準確度為95%～106%，均符合2015 年版《中國藥典》規定的生物樣品分析要求。

2.3.4.5 提取回收率、基質效應試驗 制備含5、20、200 ng/mL 二氫楊梅素的血漿樣品溶液，各平行3 份，按“2.3.3”項下方法處理，在“2.3.1”項條件下進樣測定，記錄峰面積A1；按“2.3.3”項下方法處理空白血漿后離心，上清液中加入相應質量濃度的對照品、內標溶液，在“2.3.1”項條件下進樣測定，記錄峰面積A2；用1%甲酸乙腈制成相同質量濃度的對照品、內標溶液，在“2.3.1”項條件下進樣測定，記錄峰面積A3，計算提取回收率、基質效應，公式分別為提取回收率＝A1/A2×100%、基質效應＝A2/A3×100%，測得兩者分別為 81.86%～90.99%、86.63%～101.40%，均符合生物樣品質量控制要求，表明二氫楊梅素受基質的影響較小。

2.3.4.6 穩定性試驗 制備含5、20、200 ng/mL二氫楊梅素的血漿樣品溶液，各平行3 份，按“2.3.3”項下方法處理后，分別在-80 ℃下反復凍融3 次、-20 ℃下冷凍保存15 d、室溫（25 ℃）下放置12 h，在“2.3.1”項條件下進樣測定。結果，二氫楊梅素峰面積RSD 為1.27%～6.49%，表明在上述保存條件下血漿樣品穩定性均良好。

2.3.5 數據分析 繪制血藥濃度-時間曲線，采用DAS 2.0 軟件中的二房室模型計算主要藥動學參數。

3 結果

3.1 對HepG2 細胞的抑制作用 圖2 顯示，藤茶總黃酮及其固體脂質納米粒作用24、48、72 h 后，均對細胞增殖有較強的抑制作用，并呈濃度依賴性，其中 200 μg/mL 前者作用 72 h，50～200 μg/mL后者作用48、72 h 后的體外抑制率均達到80% 以上。另外，藤茶總黃酮IC50分別為163.63 μg/mL（24 h）、89.58 μg/mL（48 h）、49.44 μg/mL（72 h），而其固體脂質納米粒分別為68.63 μg/mL（24 h）、39.99 μg/mL（48 h）、32.91 μg/mL（72 h），表明后者活性更顯著。

圖2 各樣品對HepG2 細胞抑制率的影響Fig.2 Effects of various samples on the inhibitory rate of HepG2 cells

3.2 抗肝癌活性研究 表1～3 顯示，與模型組比較，除藤茶總黃酮低劑量組外，各組對小鼠腫瘤的抑制作用比較，差異均有統計學意義（P＜0.01），而且納米?；钚詮娪谠纤?；與空白組比較，模型組、陽性藥組小鼠體質量均降低（P＜0.01），而藤茶總黃酮組、藤茶總黃酮固體脂質納米粒組無明顯變化（P＞0.05）；與空白組比較，陽性藥組小鼠胸腺、脾臟指數降低（P＜0.05，P＜0.01），可能與環磷酰胺具有較強的免疫損失有關，而其他組無明顯變化（P＞0.05）。

表1 各樣品對小鼠腫瘤的影響（，n=10）Tab.1 Effects of various samples on tumors in mice（，n=10）

表1 各樣品對小鼠腫瘤的影響（，n=10）Tab.1 Effects of various samples on tumors in mice（，n=10）

表2 各樣品對小鼠體質量的影響（，n=10）Tab.2 Effects of various samples on the body weight of mice（，n=10）

表2 各樣品對小鼠體質量的影響（，n=10）Tab.2 Effects of various samples on the body weight of mice（，n=10）

表3 各樣品對小鼠免疫器官的影響（，n=10）Tab.3 Effects of various samples on immue organs in mice（，n=10）

表3 各樣品對小鼠免疫器官的影響（，n=10）Tab.3 Effects of various samples on immue organs in mice（，n=10）

3.3 藥動學研究 血藥濃度-時間曲線見圖3，相關數據經DAS 2.0 軟件進行擬合后發現，藤茶總黃酮及其固體脂質納米粒的體內藥動學均符合二室模型。表4 顯示，藤茶總黃酮固體脂質納米粒組Cmax、Tmax、t1/2、AUC0～24h、AUC0～∞高于藤茶總黃酮組（P＜0.01），分別是后者的1.76、1.94、2.03、2.80、2.49 倍。

4 討論

圖3 各樣品血藥濃度-時間曲線Fig.3 Plasma concentration-time curves for various samples

表4 各樣品主要藥動學參數（，n=6）Tab.4 Main pharmacokinetic parameters for various samples（，n=6）

表4 各樣品主要藥動學參數（，n=6）Tab.4 Main pharmacokinetic parameters for various samples（，n=6）

本實驗結果表明，藤茶總黃酮制成固體脂質納米粒后可明顯提高其抗肝癌作用，推測可能與該劑型可改善原料藥與腫瘤細胞的親和力［17］、具有良好的腫瘤靶向遞送能力等優勢有關。采用LC-MS/MS 法檢測總黃酮主要成分二氫楊梅素的血藥濃度，發現藤茶總黃酮制成納米粒后該成分口服生物利用度顯著提高，可能是由于納米粒粒徑小，比表面積大，可增加其與胃腸道黏膜的接觸面積，從而促進藥物有效吸收［18］。另外，該納米粒能有效減緩二氫楊梅素體內消除，延長其t1/2，可能是藥物被嵌入固體脂質基質骨架中而避免外界因素破壞，增加其穩定性，并可使其在體內緩慢釋放，延長作用時間。

同時，藤茶總黃酮及其納米?？诜o藥后二氫楊梅素血藥濃度很低，但其體內抗肝癌活性較好，產生這種低生物利用度、高藥理活性現象的原因可能有（1）研究表明單次或長期大劑量連續口服二氫楊梅素時，其吸收量隨劑量及給藥時間增加而顯著升高［19］，本實驗給藥劑量大（600、2 400 mg/kg），周期長（10 d），使其血藥濃度同時具有劑量、時間上的疊加作用，從而發揮持久抑瘤活性［20］；（2）與健康大鼠比較，糖尿病模型大鼠中二氫楊梅素Cmax、AUC0～t、AUC0～∞等藥動學參數均顯著升高［21］，而本實驗目前只考察了總黃酮及其納米粒在正常大鼠體內的藥動學，而二氫楊梅素在病理狀態下的生物利用度可能會明顯增加；（3）二氫楊梅素經胃腸道代謝后產生8 種代謝產物，經腸道吸收進入血液循環，或作用于腸道菌群，或直接刺激腸道免疫應答系統，從而發揮相應藥效［22］；（4）二氫楊梅素口服后其血藥濃度降低，可能在組織分布中較高［23］，尤其是制成固體脂質納米粒后，納米載體可使其具有明顯的肝臟靶向性［24］。另外，本實驗只測定了血漿中二氫楊梅素含有量，但其在肝、脾、肺中的含有量可能會明顯升高，從而增強療效，具體將在今后作進一步研究。