運(yùn)用正交試驗(yàn)法優(yōu)化褐黃木耳母種培養(yǎng)基的配方研究

聶建軍 潘保華 李彩萍 牛 宇 徐全飛 馮婉君 蒙秋霞

運(yùn)用正交試驗(yàn)法優(yōu)化褐黃木耳母種培養(yǎng)基的配方研究

聶建軍1潘保華1李彩萍1牛 宇1徐全飛1馮婉君1蒙秋霞2

（1. 山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與經(jīng)濟(jì)研究所，太原 030006；2. 山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與資源研究所，太原 030006）

為篩選優(yōu)化褐黃木耳母種培養(yǎng)基配方，以菌絲日均長(zhǎng)速為測(cè)量指標(biāo)，菌絲長(zhǎng)勢(shì)為參考項(xiàng)，通過單因素試驗(yàn)，篩選出母種培養(yǎng)基最佳碳源和最佳氮源，并運(yùn)用正交試驗(yàn)法優(yōu)化配方。結(jié)果表明，褐黃木耳母種培養(yǎng)基最佳配方為蔗糖2%，酵母浸膏0.5%，KH2PO40.3%，MgSO4·7H2O 0.15%，瓊脂2%，pH自然。利用該配方培養(yǎng)，褐黃木耳菌絲色白、密實(shí)，平均生長(zhǎng)速度3.82 mm/d，高于正交試驗(yàn)和單因素試驗(yàn)結(jié)果。

褐黃木耳；正交試驗(yàn)；母種培養(yǎng)基；配方；優(yōu)化

褐黃木耳[(Mont.) Fari]隸屬擔(dān)子菌門、層菌綱、木耳目、木耳科、木耳屬。夏、秋季發(fā)生在槭、樺、櫟等多種闊葉樹倒木上，單生或群生。子實(shí)體較小，平伏耳片狀，平滑或稍有脈狀皺紋，初期為柔軟的膠質(zhì)，有彈性，后略呈軟骨質(zhì)，光照強(qiáng)時(shí)呈琥珀紅色或淺紫紅色，光照弱時(shí)色澤淺，呈褐黃色或粉黃色，薄而透明，干后色變深，呈棕褐色，強(qiáng)烈收縮呈硬而脆的角質(zhì)至近革質(zhì)（圖1）。子實(shí)層生于下表面，背面被絨毛，污白色至淡黃褐色。子實(shí)體質(zhì)地嫩滑，具有降血糖、降血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗癌、抗細(xì)胞突變等多種功效，極具開發(fā)利用價(jià)值[1]。

圖1 野生褐黃木耳

褐黃木耳馴化和人工栽培技術(shù)的研究日益受到重視，但其母種培養(yǎng)基的篩選尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)初步篩選出母種培養(yǎng)基最佳碳源和最佳氮源，并利用正交試驗(yàn)進(jìn)行配方優(yōu)化，結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

野生褐黃木耳子實(shí)體薄，采用耳木分離方法[2]。取長(zhǎng)有野生木耳的耳木，鋸成3 cm厚的短木片，在接種室內(nèi)，將木片外表用火輕輕灼燒，殺死表面雜菌，用滅菌的刀片切去木片表皮層，取一小塊長(zhǎng)有木耳菌絲的心材，移入PDA培養(yǎng)基試管中，接種的試管放于22～25 ℃、暗光、通氣良好的培養(yǎng)室中培養(yǎng)，挑選菌絲濃密、色澤白、生長(zhǎng)整齊的優(yōu)良菌株作為供試菌株。

1.2 培養(yǎng)基配方

①馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基[3]：馬鈴薯20%，葡萄糖2%，瓊脂2%，pH自然。

②綜合馬鈴薯葡萄糖（CPDA）培養(yǎng)基[4]：馬鈴薯20%，葡萄糖2%，K2HPO40.3%，MgSO4·7H2O 0.1%，瓊脂2%。

③碳源供試培養(yǎng)基：蛋白胨0.5%，KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O 0.1%，瓊脂2%，pH自然。

④氮源供試培養(yǎng)基：葡萄糖 2%，KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O 0.1%，瓊脂2%，pH自然。

1.3 試驗(yàn)方法

（1）菌種活化。將褐黃木耳菌種從冰箱中取出后，25 ℃下恒溫放置3天，在無(wú)菌條件下把活化菌種接種于PDA斜面培養(yǎng)基上，25 ℃下恒溫培養(yǎng)2～3天后挑取強(qiáng)壯菌絲前端，轉(zhuǎn)接于CPDA平皿培養(yǎng)基上，25 ℃下恒溫培養(yǎng)至表面長(zhǎng)滿菌絲，作為試驗(yàn)用菌種，備用。

（2）碳（氮）源篩選試驗(yàn)。將葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、可溶性淀粉5種碳源分別加入碳源供試培養(yǎng)基中（濃度均為2%），進(jìn)行碳源篩選試驗(yàn)；將蛋白胨、酵母浸膏、尿素、硝酸銨、硫酸銨5種氮源分別加入氮源供試培養(yǎng)基中（濃度均為0.5%），進(jìn)行氮源篩選試驗(yàn)。每種碳（氮）源平皿培養(yǎng)基試驗(yàn)重復(fù)6次，結(jié)果取平均值。

無(wú)菌條件下，用經(jīng)滅菌的打孔器（直徑5 mm）均勻截取經(jīng)活化的褐黃木耳菌種，分別接種于直徑為9 cm的不同碳（氮）源平皿培養(yǎng)基（溶化的培養(yǎng)基約25 mL）中央，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)，3天后開始觀察菌絲生長(zhǎng)情況，并采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，記錄菌絲長(zhǎng)勢(shì)，連續(xù)觀測(cè)記錄10天。

（3）正交試驗(yàn)優(yōu)化母種培養(yǎng)基配方。根據(jù)碳、氮源單因素試驗(yàn)結(jié)果，把篩選出的最佳碳源、最佳氮源和無(wú)機(jī)鹽KH2PO4、MgSO4·7H2O 組成正交試驗(yàn)9個(gè)不同處理的培養(yǎng)基，采用4因素3水平正交試驗(yàn)法，優(yōu)化出褐黃木耳母種培養(yǎng)基最佳配方。

用經(jīng)滅菌的直徑5 mm打孔器均勻截取經(jīng)活化的褐黃木耳菌絲體組織塊，在無(wú)菌條件下分別接種于正交試驗(yàn)9個(gè)不同處理的直徑為9 cm的平皿培養(yǎng)基（溶化的培養(yǎng)基約25 mL）中央，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)。3天后開始連續(xù)10天觀察菌絲生長(zhǎng)情況，并以接種塊為中心用十字交叉法測(cè)量菌落直徑（mm），隨機(jī)測(cè)量3 次，結(jié)果取平均值[5]，同時(shí)記錄菌絲長(zhǎng)勢(shì)。

菌絲日均長(zhǎng)速計(jì)算公式：= [(–5)/2]/。

式中：表示菌落直徑（mm），表示培養(yǎng)時(shí)間（d）。各試驗(yàn)因素及其水平見表1。

表1 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)的因素和水平設(shè)計(jì)（%）

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS16.0軟件進(jìn)行分析，多重比較采用鄧肯新復(fù)極差檢驗(yàn)法（Duncan′s Multiple Ranger Test，DMRT）。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源篩選結(jié)果

由表2可以看出，在相同培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)條件下，以蔗糖作為碳源的菌絲平均長(zhǎng)速較快，為2.92 mm/d，與其他4種碳源差異達(dá)極顯著水準(zhǔn)。菌絲色白、密實(shí)。綜合比較，選擇蔗糖作為褐黃木耳母種培養(yǎng)基的最佳碳源。

表2 不同碳源和氮源的菌絲平均長(zhǎng)速和菌絲長(zhǎng)勢(shì)

注：①同列數(shù)據(jù)后小寫英文字母和大寫英文字母分別表示Duncan多重比較法檢測(cè)結(jié)果差異顯著性（=0.05，=0.01）；②致密、密實(shí)、細(xì)密、稀疏表示菌絲長(zhǎng)勢(shì)依次減弱；③淀粉為可溶性淀粉。

2.2 氮源篩選結(jié)果

由表2可以看出，在相同培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)條件下，以酵母浸膏為氮源的培養(yǎng)基菌絲平均長(zhǎng)速較快，為2.85 mm/d，與其他4種氮源差異達(dá)極顯著水準(zhǔn)。菌絲色白、密實(shí)。綜合比較，選擇酵母浸膏作為褐黃木耳母種培養(yǎng)基的最佳氮源。

2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化褐黃木耳母種培養(yǎng)基配方結(jié)果

從L9(34) 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與極差分析結(jié)果（表3）可知，影響褐黃木耳母種培養(yǎng)基配方的因素依次為（B）酵母浸膏>（A）蔗糖>（C）KH2PO4>（D）MgSO4·7H2O；褐黃木耳母種培養(yǎng)基最佳配方組合為A1B1C3D3，即最佳配方為蔗糖2%，酵母浸膏0.5%，KH2PO40.3%，MgSO4·7H2O 0.15%，瓊脂2%，pH自然。

表3 培養(yǎng)基配方正交試驗(yàn)結(jié)果

2.4 最佳配方驗(yàn)證試驗(yàn)

對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果所得的最佳配方（蔗糖2%，酵母浸膏0.5%，KH2PO40.3%，MgSO4·7H2O 0.15%，瓊脂2%，pH自然）進(jìn)行6次重復(fù)試驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果顯示，在其他條件相同情況下，利用該配方培養(yǎng)，菌絲均色白、密實(shí)，菌絲平均長(zhǎng)速分別為3.86、3.78、3.91、3.85、3.72及3.81 mm/d，平均值3.82 mm/d，高于正交試驗(yàn)和單因素試驗(yàn)的每組結(jié)果。

3 結(jié) 論

碳源不僅是褐黃木耳合成菌體細(xì)胞必不可少的原料，也是其生命活動(dòng)的能量來(lái)源，氮源則是合成蛋白質(zhì)和核酸的重要原料。褐黃木耳的生長(zhǎng)發(fā)育還需要一定的無(wú)機(jī)鹽類，其中以磷、鉀、鎂3種元素尤為重要[6]。

通過單因素試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，褐黃木耳母種培養(yǎng)基的最佳碳源是蔗糖，最佳氮源是酵母浸膏。運(yùn)用正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化褐黃木耳母種培養(yǎng)基配方，結(jié)果最佳配方為蔗糖2%，酵母浸膏0.5%，KH2PO40.3%，MgSO4·7H2O 0.15%，瓊脂2%，pH自然。

本研究是在篩選出褐黃木耳母種培養(yǎng)基單一碳源和氮源的基礎(chǔ)上進(jìn)行的，關(guān)于選用復(fù)合碳源和氮源對(duì)母種培養(yǎng)基配方進(jìn)行優(yōu)化，其菌絲生長(zhǎng)特性有無(wú)改變，馴化栽培產(chǎn)量是否受影響，有待進(jìn)一步研究探討。

[1] 潘保華, 聶建軍, 徐全飛, 等. 山西大型真菌野生資源圖譜[M]. 北京: 科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社, 2018.

[2] 蘭進(jìn), 陳向東, 曾念開. 名貴藥用真菌栽培技術(shù)問答[M]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2014.

[3] 田夢(mèng)媛, 高原, 杜雙田, 等. 27個(gè)香菇菌株農(nóng)藝性狀比較研究[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2019, 24(1): 82-91.

[4] 陳立佼, 柴紅梅, 黃興奇, 等. 尖頂羊肚菌單孢菌株群體培養(yǎng)特性研究[J]. 生物技術(shù), 2011, 21(6): 63-70.

[5] 劉娜, 宋瑩, 呂立濤, 等. 5株梯棱羊肚菌菌絲生長(zhǎng)特性研究[J]. 中國(guó)食用菌, 2019, 38(9): 21-28.

[6] 方芳, 宋金娣, 馮吉慶, 等. 食用菌生產(chǎn)大全[M]. 南京: 江蘇科學(xué)技術(shù)出版社, 2007.

Optimum of stock culture medium formula ofby orthogonal test

Nie Jianjun1Pan Baohua1Li Caiping1Niu Yu1Xu Quanfei1Feng Wanjun1Meng Qiuxia2

（1.Institute of Agricultural Resources & Economy, Shanxi Academy of Agricultural Sciences,Taiyuan, Shanxi 030006, China；2. Institute of Agricultural Environment & Resources , Shanxi Academy of Agricultural Sciences,Taiyuan, Shanxi 030006, China）

Taking the average daily growth rate of hypha as the measurement index and hypha growth potential as the reference item, the best carbon source and the best nitrogen source ofstock culture medium were selected through single factor experiment, and the formula of stock culture medium was optimized by orthogonal test. The results showed that the optimal formula of stock culture medium forwas: sucrose 2%, yeast extract 0.5%, KH2PO40.3%, MgSO4·7H2O 0.15%, agar 2%, and natural pH.

; orthogonal test; stock culture medium; formula; optimization

S646

B

2095-0934（2020）05-318-04

山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院山西“農(nóng)谷”研發(fā)專項(xiàng)資助項(xiàng)目（YCX2018204）；山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化與示范推廣資助項(xiàng)目（2019CGZH07-2）；山西省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（農(nóng)業(yè)）資助項(xiàng)目（201803D221011-1）；山西省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃資助項(xiàng)目（201903D221046）

聶建軍（1969—），男，副研究員，現(xiàn)主要從事食藥用菌等研究工作。E-mail：njjj666@126.com。