縱條紋炭角菌中環肽Xylastriamide A培養條件的優化

茍 歡 王 莉 范一婷 賀新生 袁小紅

縱條紋炭角菌中環肽Xylastriamide A培養條件的優化

茍 歡 王 莉 范一婷 賀新生 袁小紅*

（西南科技大學生命科學與工程學院，四川 綿陽 621010）

為優化縱條紋炭角菌中環肽Xylastriamide A的固體培養和液體培養條件，采用高效液相色譜法，測定分析固體培養培養料不同棉籽殼與麥麩比例配方，及液體培養不同碳源、氮源和培養時間的環肽Xylastriamide A含量差異。結果：固體培養，以培養料中的棉籽殼/麥麩比為70/30時，子實體的環肽Xylastriamide A含量較高，達578.20 μg/g；液體培養，最佳碳源和最佳氮源分別為麥芽糖和酵母浸出粉，培養14天得到的菌絲球環肽Xylastriamide A含量分別達到9.77 μg/g和19.95 μg/g。

縱條紋炭角菌；高效液相色譜法；固體培養；液體培養

縱條紋炭角菌（），隸屬于子囊菌亞門、炭角菌科、炭角菌屬，廣泛分布在廣西、四川、貴州、海南等地區[1]。本課題組對縱條紋炭角菌進行多年研究，發現其具有抗菌[2]、抗氧化[3]、抗腫瘤[4]、改善睡眠[5]等藥理活性。已有學者對縱條紋炭角菌子實體成分及其效應進行研究[6-10]，雷傳文等[10, 11]采用HPLC半制備方法分離得到新的環肽Xylastriamide A，并通過體外藥理活性試驗，發現Xylastriamide A具有顯著的抗腫瘤活性，在濃度為40 μmoL/L時對腫瘤細胞株的抑制率超過65%，對秀麗隱桿線蟲也有一定的抗蟲活性，其IC50值為103.54 μg/mL。為進一步研究和開發這類新的環肽Xylastriamide A成分，在前期試驗所得的縱條紋炭角菌子實體最適培養條件[12]和菌絲最適液體培養條件[13]的基礎上，我們通過測定不同培養條件下環肽Xylastriamide A的含量，對其環肽Xylastriamide A的培養條件進行了優化。

1 材料與方法

1.1 設備與材料

（2）試劑。環肽Xylastriamide A對照品（實驗室自制）；乙腈，色譜純（塞默飛世爾科技有限公司）；其余試劑均為分析純。

1.2 試驗方法

（1）固體培養試驗。設9種培養料配方，其棉籽殼/麥麩比分別為100/0，95/5，90/10，85/15，80/20，75/25，70/30，65/35，60/40，加水量為棉籽殼和麥麩總量的1.3倍[14]。按不同比例配方得到的縱條紋炭角菌子實體分別標記為樣品a、b、c、d、e、f、g、h、i。每種配方設3個重復，以防接種后有污染。

取36個罐頭瓶，將配制好的培養料裝罐，每瓶裝料重50 g，120 ℃高壓滅菌1 h。待罐頭瓶冷卻后，在超凈工作臺上接種。為便于后期觀察菌絲生長情況，接種方法為在培養料緊挨瓶壁處挖一個小孔，接入1 cm2左右的菌種。接種完成后放入25 ℃恒溫箱中培養55天。將培養得到的縱條紋炭角菌子實體從瓶中摘下。記錄每配方子實體數量、鮮重，三次測其長度取平均值后，置于60 ℃烘干箱內干燥24 h，測得干重，并進行檢測。

（2）液體培養試驗。液體基礎培養基配方：葡萄糖4%，蛋白胨0.4%，硫酸鎂0.15%，磷酸二氫鉀0.3%[13]，pH自然。配制540 mL培養基，均勻分裝至9個100 mL的錐形瓶中，每瓶裝60 mL，基礎培養基設3次重復。碳源試驗配方：僅改變液體基礎培養基中的碳源葡萄糖為乳糖、蔗糖、麥芽糖。氮源試驗配方：僅改變液體基礎培養基中的氮源蛋白胨為黃豆餅粉、酵母浸出粉。

采用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌，121 MPa下保持30 min。滅菌完畢后取出培養基，放置在超凈工作臺上，待冷卻至常溫后按無菌操作進行接種。接種步驟：選取生長良好的試管菌種，點燃酒精燈，將接種環在酒精燈下灼燒滅菌，冷卻后取1 cm左右的菌種塊接入錐形瓶中。接種完成后，于30 ℃、轉速120 r/min下振蕩培養。收集培養13天、14天、15天的菌絲球，將發酵液過濾分離，置于60 ℃干燥箱內干燥12 h，測其干重。由于在預試驗中已經確定培養液不含環肽Xylastriamide A，因此直接檢測菌絲球。

1.3 檢測波長的確定

對環肽Xylastriamide A對照品在200～400 nm范圍內進行紫外檢測，結果在254 nm處有最大吸收峰，故本試驗選擇254 nm為檢測波長。

1.4 色譜條件

1.5 對照品溶液的制備

精確稱取縱條紋炭角菌環肽，加乙腈溶解配置成3.5 μg/mL、5 μg/mL、7 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL、70 μg/mL的對照品。

1.6 供試品溶液的制備

（1）固體培養的供試樣品制備。將固體培養得到的縱條紋炭角菌子實體制成供試樣品溶液，由于培養料配方不同及有部分培養罐被污染，導致各配方產量不一致。精確稱取樣品a為2.00 g、b為2.00 g、c為5.00 g、d為4.10 g、e為5.10 g、f為6.19 g、g為3.04 g、h為4.05 g、i為4.12 g，為使培養得到的子實體利用最大化，將其置于錐形瓶中，按照1∶10加入乙醇搖勻靜置浸提3 h，過濾，再將濾渣按上述方法重新浸提2次，共9 h。將濾液倒入旋蒸瓶內，50 ℃水浴旋蒸蒸發乙醇至樣品呈浸膏狀，再按質量比1∶4加入水，溶解浸膏。加入相同量的二氯甲烷萃取，重復3次，得到含環肽的萃取液[8]。

將萃取液倒至旋蒸瓶中，50 ℃水浴旋蒸蒸發乙醇至樣品呈浸膏狀，再加1 mL甲醇進行溶解，置于離心管中，0.45 μm微孔濾膜過濾，去濾液作為固體供試樣品溶液。

（2）液體培養的供試樣品制備。將液體培養的菌絲球干燥后精確稱重，置于錐形瓶中，按照1∶10加入甲醇搖勻靜置浸提3 h，過濾，再將濾渣按上述方法重新浸提2次，共9 h。由于菌絲球產量遠少于子實體，因此未用二氯甲烷萃取除雜，以避免萃取過程增加環肽Xylastriamide A的損失。

將濾液旋蒸成浸膏，再直接加甲醇溶解至離心管1 mL處，0.45 μm微孔濾膜過濾，去濾液作為液體供試樣品溶液。

2 結果與分析

2.1 固體培養的子實體生長情況

由表1可知，各配方生物學效率，以棉籽殼/麥麩比75/25為最高，達13.73%；90/10、80/20、60/40配方也較高；全部為棉籽殼的配方生物學效率最低，僅為4.45%。

表1 不同固體培養料配方的子實體生長比較

2.2 線性關系考察

分別取縱條紋炭角菌環肽對照品溶液3.5 μg/mL、5 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL各20 μL進樣，測定對照品溶液吸收峰峰面積（圖1）。以質量濃度（）為橫坐標，峰面積（）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程=21.122– 61.954（2=0.9838，n=5）（圖2）。表明縱條紋炭角菌環肽線性關系良好。

圖1 環肽Xylastriamide A對照品色譜圖

圖2 環肽標準曲線

2.3 固體培養中不同棉籽殼/麥麩比對環肽Xylastriamide A含量的影響

通過高效液相色譜法測定固體培養子實體的環肽Xylastriamide A含量（表2），結果以固體培養料中的棉籽殼/麥麩比為70/30時，子實體的環肽含量較高，達578.20 μg/g，不同棉籽殼/麥麩比處理的平均環肽含量為153.19 μg/g。

表2 固體培養的縱條紋炭角菌環肽XylastriamideA含量

注：a～i表示不同比例配方固體培養得到的子實體樣品，j表示野生縱條紋炭角菌。

2.4 液體培養中不同碳源、氮源及培養時間對環肽Xylastriamide A含量的影響

通過高效液相色譜法測定，由峰面積等數據得到液體培養菌絲球環肽Xylastriamide A含量。結果（表3）表明，液體培養中以酵母粉為氮源培養14天的菌絲球環肽含量較多，為19.95 μg/g；以麥芽糖為碳源培養14天的菌絲球環肽含量較多，為9.77 μg/g。檢測培養15天的酵母浸出粉、葡萄糖培養基的菌絲球環肽含量為0。這可能是由于環肽被全部降解所致。所有液體培養基配方處理的環肽含量均在第14天達到峰值，之后都有不同程度的降解。

表3 液體培養的縱條紋炭角菌環肽Xylastriamide A含量

在液體培養過程中發現培養基有不同程度的污染，其中以黃豆餅粉為氮源的培養基污染最為嚴重，原因可能是黃豆餅粉沒有經過熬制，滅菌不夠徹底等，因此棄用。其他液體培養基也有輕度污染，可能是因接種等環節操作不當所致。

3 討 論

本研究為提高縱條紋炭角菌中環肽Xylastriamide A的含量，探索其優化培養條件。試驗結果表明，固體培養不同棉籽殼/麥麩料比例配方的環肽含量有較大差異，以棉籽殼/麥麩比為70/30時環肽含量較高，達578.20 μg/g。培養料中的麩皮占比對子實體環肽含量的影響較大。液體培養條件優化試驗結果：最佳氮源為酵母浸出粉，最佳碳源為麥芽糖。各液體培養基配方處理均在第14天達到峰值，之后都有不同程度的降解，尤其酵母浸出粉和葡萄糖配方處理的菌絲球在第15天時檢測不到環肽。這是否與液體培養溫度、培養時間、檢測時間、檢測線等有關，需要進一步研究。

與液體培養相比，固體培養所得的子實體環肽Xylastriamide A含量更高。其含量高低可能與生長發育階段有很大關系。但液體培養時間比固體培養時間短很多，因此更適合用于生產。后期可以加大液體培養，設計最佳方案以獲取更多的環肽Xylastriamide A，為后續生物活性研究奠定基礎。

[1] ZhuYF, Guo L.hainanensis sp. Nov. (Xylariaceae) from China[J]. Mycosystema, 2011, 30(4): 526-528.

[2] 袁小紅, 張春杰, 劉霞, 等. 6種高等真菌醇提物對植物病原菌的抗菌活性研究[J]. 安徽農業科學, 2013, 41(12): 5289-5290, 5294.

[3] Liu XL, Dong MS, Chen XH,. Antioxidant activity and phenolics of an endophyticsp. from Ginkgo biloba[J]. Food Chemistry, 2007, 105(2): 548-554.

[4] 袁小紅, 張春杰, 鄭仁林, 等. 六種高等真菌醇提物的抗腫瘤活性篩選[J]. 西南科技大學學報, 2013, 28(3): 95-97.

[5] 黃毅, 雷傳文, 袁小紅, 等. 一種縱條紋炭角菌的應用[P]. 中國: ZL201510662473.2, 2019-7-16.

[6] 羅靜, 楊偉, 伍嬌琪, 等. 縱條紋炭角菌石油醚萃取物的揮發性成分分析[J]. 安徽農業科學, 2017, 45(17): 1-3.

[7] 黃毅, 袁小紅, 賀新生, 等. 不同培養方式產縱條紋炭角菌的指紋圖譜分析[J]. 安徽農業科學, 2016（8）: 134-137.

[8] 黃毅, 雷傳文, 宋航, 等. 高速逆流色譜法用于縱條紋炭角菌中過氧麥角甾醇的分離純化[J]. 食品工業科技, 2016, 37(17): 262-266.

[9] 劉霞. 縱條紋炭角菌抗菌活性次生代謝產物研究[D]. 綿陽: 西南科技大學, 2015.

[10] 雷傳文, 李國友, 楊智芹, 等. 縱條紋炭角菌子實體的化學成分研究[J]. 中藥材, 2017, 40(3): 604-607.

[11] 雷傳文. 縱條紋炭角菌子實體化學成分及生物活性研究[D]. 綿陽: 西南科技大學, 2017.

[12] 馮望, 吳穎, 尤雅, 等. 縱條紋炭角菌培養條件的優化[J]. 廣東農業科學, 2014(10): 90-93.

[13] 劉霞, 高聰, 鐘雨婷, 等. 縱條紋炭角菌菌絲液體培養條件的優化[J]. 中藥材, 2014, 37(8): 1317-1321.

[14] 馬貝貝, 霍存錄, 孫曉玲, 等. 縱條紋炭角菌子實體培養[J]. 食品與發酵科技, 2013(2): 44-46.

Optimization of culture conditions of cyclopeptide Xylastriamide A in

Gou Huan Wang Li Fan Yiting He Xinsheng Yuan Xiaohong*

（School of Life Science and Engineering, Southwest University of Science And Technology, Mianyang, Sichuan 621010, China）

The content of cyclopeptide Xylastriamide A inwas increased by optimizing the culture conditions. Determination of cyclopeptide Xylastriamide A inby HPLC. The solid culture materials were optimized, and the content of cyclopeptide Xylastriamide A in different ratios of cottonseed hull and wheat bran of culture medium formulas were compared; and the liquid culture which was based on the basic mediumwas to compare the content of cyclopeptide Xylastriamide A in different carbon sources, nitrogen sources and culture time. The results showed that when the ratio of cottonseed hull to wheat bran was 70∶30 in culture medium formula, the content of cyclopeptide Xylastriamide A in fruiting body was as high as 578.20 μg/g. In liquid culture, The best carbon source and nitrogen source were maltose and yeast powder, the Xylastriamide A content of mycelium after 14 days of culture was 9.77 μg/g and 19.95 μg/g, respectively.

; HPLC; solid culture; liquid culture

S646，R285

B

2095-0934（2020）05-309-05

國家自然科學基金項目（21272189）；四川省大學生創新創業訓練計劃資助項目（201810619088）；中國國家轉基因重大專項（2019ZX08010-004）

茍歡（1998—），女，四川南充人，研究方向為天然產物化學。E-mail：1203522826@qq.com。

袁小紅，博士，教授，研究方向為天然藥物和保健食品。E-mail：419225263@qq.com。