潰瘍性結腸炎小鼠血清miR-23a-3p 和miR-27a-3p 的表達 水平及其作用的研究

陳 巍，韓 崢，鄒艷麗，黃莎莎，田 霞

武漢大學附屬同仁醫院（武漢市第三醫院）消化內科，武漢 430060

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種消化道炎癥性疾病，主要表現為結腸和直腸彌漫性、連續性淺表炎癥，并伴隨著相應的組織學變化[1]。臨床上常表現為出血性腹瀉、腸運動時腹部痙攣等，嚴重影響患者的生活質量，給患者及社會帶來沉重的經濟負擔[2-3]。UC 發病原因及機制并不十分明確，其治療方法也較為局限[4]。腸上皮細胞作為腸黏膜屏障中的主要組成部分，其凋亡水平影響腸黏膜屏障功能的維持。UC 嚴重的炎癥反應可使腸道屏障通透性增加，腸上皮細胞凋亡加劇，腸道穩態被破壞，甚至促發癌變[5]。因此，了解UC 中腸上皮細胞凋亡機制，對于維持腸道穩態具有一定的意義，也可為緩解UC 癥狀提供新的治療方向。

通過生物信息學方法，篩選出UC 致病相關基因，并進行全面分析，找出與疾病相關的核心基因，有利于為UC 的研究提供新的思路[6]。研究[7]表明，miRNA 在腸道黏膜中的差異表達對炎癥性腸病的腸道屏障功能具有重要的調控作用。在前期研究中，對比分析UC 腸黏膜和正常腸黏膜GEO（gene expression omnibus）芯片數據，篩選出了35 個差異miRNA 及其對應的靶基因，其中miR-23a-3p 和miR-27a-3p 可能分別對過氧化物酶體增殖物激活受體γ 輔助激活因子1α（peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator 1α，PPARGC1A）和PH 域富含亮氨酸重復蛋白磷酸酶2（PH domain leucine-rich repeat protein phosphatase 2，PHLPP2）基因具有調控作用（尚未發表）。而PPARGC1A 和PHLPP2 皆與線粒體途徑介導的細胞凋亡相關[8-9]。因此，本研究擬通過小鼠UC 模型探究miR-23a-3p 和miR-27a-3p 在UC 小鼠血清中的表達水平及在UC 中可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

20 只雄性SPF 級C57BL/6 小鼠購自三峽大學實驗動物中心，實驗動物生產許可證號為SCXK（鄂）2017-0012，6 ～7 周齡，飼養于武漢華聯科生物技術有限公司模型動物研究院SPF 級動物房，實驗動物使用許可證號為SYXK（鄂）2018-0104，適應性飼養1 周。飼養條件：溫度22 ～26 ℃，相對濕度50%～60%，人工光照每日明暗各12 h。本動物實驗操作符合《實驗動物管理條例》的相關規定。

1.2 主要試劑

硫酸葡聚糖鈉（dextran sulfate sodium，DSS）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、四甲基乙二胺（tetramethylethylenediamine，TEMED）、過硫酸銨購自美國Sigma 公司；糞便隱血檢測試劑盒購自安徽深藍醫療科技股份有限公司；反轉錄試劑盒購自日本TaKaRa 公司；SYBR Green PCR 試劑盒購自美國KAPA Biosystems 公司；聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）轉移膜、化學發光試劑購自美國Millipore 公司；蛋白質標志物購自美國Thermo公司；白細胞介素1β（interleukin 1β，IL-1β）、IL-6 及腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）ELISA 試劑盒，兔抗鼠PPARGC1A、PHLPP2、B 淋巴細胞瘤2 蛋白（B-cell lymphoma-2，BCL-2）、Bcl-2 相關X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，BAX）、細胞色素C（cytochrome c， CYT-C）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ，GAPDH）抗體、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase ，HRP）標記的山羊抗兔IgG 均購自武漢貝茵萊生物科技有限公司；兔抗鼠胱天蛋白酶3 剪切體（cleaved cysteine-containing aspartate-specific proteases，cleavedcaspase-3）抗體購自英國Abcam 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組及模型構建 將20 只C57BL/6 小鼠隨機分為對照組和模型組，每組10 只。模型組小鼠自由飲用每日新鮮配制的5% DSS 溶液[10]，對照組正常飲水。每日記錄小鼠體質量、進食情況、精神狀態等一般情況，觀察小鼠糞便形態并采用糞便隱血檢測試劑盒檢測糞便隱血情況。DSS 誘導7 d 后，收集小鼠全血，分離血清，然后將小鼠頸椎脫臼處死，剖腹取出小鼠結腸，觀察結腸病理變化，并測量其長度，稱取質量（濕重），取遠端結腸于4%中性甲醛中固定，剩余結腸組織于-80 ℃冰箱中保存。

1.3.2 小鼠疾病活動指數評分 根據小鼠糞便性狀、隱血情況以及體質量下降百分比計算小鼠疾病活動指數（disease activity index，DAI）[11]，評分等級：①糞便性狀正常為0 分，軟便（不黏附于肛門的半成形糞便）為1 ～2 分， 腹瀉（可黏附于肛門的不成形糞便）為3 ～4 分。 ②糞便隱血陰性為0 ～1 分（陰性為0 分，當同時出現軟便或體質量下降1%～5%為1 分），隱血陽性為2 ～3分，肉眼血便為4 分。③體質量無下降為0 分，體質量下降≤ 5%為1 分，下降>5%且≤ 10%為2 分，下降>10% 且≤ 15%為3 分，下降>15%為4 分。DAI= （糞便性狀計分+糞便隱血計分+體質量下降計分） /3，通過DAI 評估造模后小鼠結腸炎嚴重程度。

1.3.3 蘇木精-伊紅染色觀察結腸組織病理形態 取出固定的結腸組織，進行脫水、浸蠟包埋后，切成厚度為4 μm 的組織切片。水浴中展片，將切片貼附于載玻片上，然后烤片。將組織切片脫蠟至水，經過蘇木精染液染色5 min，伊紅染液染色3 min，水洗后梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，于顯微鏡下觀察拍照。采用Geboes 分級指數[11]評估結腸組織病理學變化。

1.3.4 ELISA 檢測血清中IL-1β、IL-6 及TNF-α 水平 采用ELISA 試劑盒檢測小鼠血清中IL-1β、IL-6 及TNF-α 濃度，實驗操作按照試劑盒說明書進行。

1.3.5 qRT-PCR 檢測血清中miR-23a-3p 和miR-27a-3p表達 提取小鼠血清總RNA，反轉錄合成cDNA，再以cDNA 為模板進行PCR 擴增，以U6 為內參基因，采用2－??CT法計算miR-23a-3p、miR-27a-3p 相對表達量（表1）。

表1 qRT-PCR 引物序列Tab 1 Primer sequences for qRT-PCR

1.3.6 Western blotting 檢測PPARGC1A、PHLPP2、BAX、BCL-2、CYT-C 和cleaved-caspase-3 蛋白表達 RIPA 裂解液裂解小鼠結腸組織，提取總蛋白。蛋白質定量后，以20 μg 蛋白上樣量進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離，將蛋白轉移至PVDF 膜。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h 后，加入一抗稀釋液（抗PPARGC1A、PHLPP2、BAX、BCL-2、CYT-C、GAPDH 抗體稀釋比1:1 000，抗cleaved-caspase-3 抗體稀釋比1:5 000），濕盒中室溫孵育1 h。洗膜后，加入經HRP 標記的二抗（稀釋比1:20 000），濕盒中室溫孵育1 h。洗膜，滴加化學發光試劑于暗室中顯影，置于全自動化學發光分析儀中檢測，讀取條帶灰度值。

1.4 統計學分析

采用SPSS 22.0 軟件進行統計學分析，定量資料用x—±s 表示，2 組間比較采用獨立樣本t 檢驗，P<0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠DAI 評估分析

在DSS 誘導期間，對照組小鼠的采食、毛發以及日常活動情況均正常，而模型組小鼠逐漸出現精神萎靡、采食減少、體質量減輕、腹瀉、肛周毛發被污染，肉眼血便等現象。對2 組小鼠的體質量下降比例、糞便性狀及隱血情況進行評分，結果顯示，與對照組（DAI=0）比較，模型組DAI 評分（3.84±0.21）顯著升高（P=0.000）。

2.2 小鼠結腸濕重及長度比較

DSS 誘導后，小鼠結腸長度縮短、濕重減輕，與對照組相比，差異具有統計學意義（均P=0.000，見圖1、 表2）。

圖1 對照組（A）和模型組（B）小鼠的結腸組織長度Fig 1 Lengths of colon tissues in control group (A) and model group (B)

表2 對照組和模型組結腸組小鼠織濕重及長度比較Tab 2 Comparison of wet weights and lengths of colon tissues between control group and model group

2.3 小鼠結腸組織病理觀察

通過蘇木精-伊紅（H-E）染色觀察發現，模型組小鼠結腸組織中出現炎癥細胞嚴重浸潤的現象，組織結構被破壞，局部出現糜爛和潰瘍（圖2）。統計2 組結腸組織的Geboes 分級指數，對照組為0.83±0.31，模型組為10.53±2.80，差異具有統計學意義（P=0.004）。

2.4 小鼠血清中IL-1β、IL-6 及TNF-α 水平比較

與對照組比較結果見表3，模型組小鼠血清中IL-1β、 IL-6 及TNF-α 濃度均顯著升高，差異具有統計學意義（均P=0.000）。

圖2 小鼠結腸組織病理學變化（H-E 染色，×400）Fig 2 Histopathological changes of the colons in mice observed (H-E staining, ×400)

表3 對照組和模型組小鼠血清中IL-1β、IL-6 及TNF-α 水平比較Tab 3 Comparison of levels of IL-1β, IL-6 and TNF-α in mice sera between control group and model group

2.5 小鼠血清中miR-23a-3p、miR-27a-3p 表達的變化

與對照組比較結果見圖3，模型組小鼠血清中miR-23a-3p 和miR-27a-3p 表達水平均顯著降低（P=0.001，P=0.007）。

2.6 小鼠結腸組織中PPARGC1A、PHLPP2 蛋白表達變化

與對照組比較，模型組PPARGC1A 和PHLPP2 的蛋白表達水平均顯著升高，差異具有統計學意義（均P=0.000，圖4）。

圖3 對照組和模型組小鼠血清中miR-23a-3p、miR-27a-3p 表達水平的比較Fig 3 Comparison of the expression levels of miRNA-23a-3p and miRNA-27a-3p in mice sera between control group and model group

2.7 小鼠結腸組織中線粒體凋亡相關蛋白表達變化

檢測小鼠結腸組織中線粒體凋亡相關蛋白表達水平，結果顯示：與對照組比較，模型組BAX、CYT-C 和cleaved-caspase-3 表達水平顯著升高，而BCL-2 表達顯著降低，差異均具有統計學意義（均P=0.000，圖5）。

圖4 Western blotting 檢測小鼠結腸組織中PPARGC1A 和PHLPP2 蛋白的表達Fig 4 Expressions of PPARGC1A and PHLPP2 in mice colons detected by Western blotting

圖5 Western blotting 檢測小鼠結腸組織中BAX、BCL-2、CYT-C 和cleaved-caspase-3 蛋白的表達Fig 5 Expressions of BAX, BCL-2, CYT-C and cleaved-caspase-3 in mice colons detected by Western blotting

3 討論

DSS 誘導UC 小鼠模型，簡單易操作，被廣泛應用于實驗研究中[11]。本研究采用5% DSS 連續自由飲用7 d 構建UC 模型，小鼠出現體質量減輕、腹瀉、便血等癥狀，DAI 評分顯著升高，結腸長度縮短，濕重減輕，提示模型構建成功。腸黏膜屏障主要由黏膜基底膜、上皮細胞層及細胞分泌的黏液層構成，是腸道發揮正常功能，抵御外來抗原入侵的重要防線[13]。腸黏膜屏障完整性受損是UC 等炎癥性腸病的主要特征之一，本研究結果顯示模型組小鼠結腸中出現炎癥細胞浸潤，黏膜出現潰瘍、糜爛等現象，符合UC 病理特征。炎癥細胞因子作為炎癥介質在UC 腸黏膜病理性損傷中發揮重要的介導作用，IL-1β[14]、IL-6[15]、 TNF-α[16]等促炎因子引起腸道炎癥反應，誘發或加重UC[17]。檢測UC 小鼠血清中細胞因子水平，IL-1β、IL-6及TNF-α 水平均顯著高于對照組正常小鼠，說明UC 小鼠機體內炎癥反應嚴重，與病理觀察結果一致。

miRNA 是一種內源性非編碼RNA，在機體正常生理以及疾病發生、發展等方面均具有重要的調控作用，是基因調控網絡的重要組成部分[18]。miRNA 通過與目標mRNA 的3'非翻譯區（untranslated region，UTR）區域結合后將其降解，抑制mRNA 翻譯，從而發揮對靶基因特異性調控的功能[19]。大量研究[20-21]發現，miRNA 可通過調控腸上皮細胞功能，影響腸黏膜屏障，因此研究UC 差異表達的miRNA 可能為UC 的治療提供更多的可能。miR-23a 在UC 中的調控作用已有相關文獻報道[22]，且miR-23a-3p 在UC 臨床診斷中具有重要意義，是一種潛在的診斷和預后指標[23]，但miR-23a-3p 在UC 中具體作用并不明確。在本研究中，我們探究了通過生物信息技術篩選出與UC 相關的miR-23a-3p 和miR-27a-3p 在正常小鼠和UC 小鼠血清中的表達水平，及其可能調控基因PPARGC1A、PHLPP2 在結腸組織中的表達水平，結果顯示miR-23a-3p 和miR-27a-3p 在模型組小鼠血清中的表達均明顯低于正常小鼠，而PPARGC1A 和PHLPP2 在結腸組織中的表達顯著升高。根據已有文獻[24]報道，miR-23a和miR-27a 可通過caspase 依賴或caspase 非依賴途徑誘導細胞凋亡，且PPARGC1A 和PHLPP2 均與細胞線粒體凋亡途徑相關[8-9]，因此我們推測miR-23a-3p 和miR-27a-3p可能是UC 潛在的標志物，其在血清中表達下調，調控的靶基因PPARGC1A 和PHLPP2 在結腸組織中的表達升高，誘導線粒體凋亡途徑，介導結腸上皮細胞凋亡，破壞腸黏膜屏障完整性，從而參與UC 的病程進展。

BCL-2/BAX 在線粒體途徑介導的caspase 依賴性凋亡中發揮重要的作用，BCL-2 為抑凋亡蛋白，BAX 為促凋亡蛋白，BAX 轉移至線粒體膜，可降低線粒體膜電位，改變膜通透性，導致CYT-C 從線粒體中釋放，觸發caspase-3 凋亡級聯反應[25]。本研究結果顯示，模型組小鼠結腸組織中BAX、CYT-C 及cleaved-caspase-3 表達上調，而BCL-2 表達下調，提示UC 小鼠結腸組織中線粒體凋亡途徑被激活，驗證了上述PPARGC1A 和PHLPP2 表達上調引發線粒體凋亡途徑的推論。

綜上所述，miR-23a-3p 和miR-27a-3p 在UC 小鼠血清中表達下調，可能降低了對PPARGC1A 和PHLPP2 的抑制調控，觸發結腸組織中線粒體途徑誘導細胞凋亡，破壞腸黏膜屏障，從而參與了UC 的發生和發展。但本研究未對幾個分子之間的相互關系進行驗證，因此有待進一步的實驗加以證實。此外，本研究的UC 模型小鼠血清中miR-23a-3p 呈低表達，與Wu 等[26]研究發現的miR-23a在UC 患者組織中表達增加的結果存在差異，可能是由于所檢測的miRNA 亞型不同所導致。由于miR-23a-3p 在UC 中的具體作用機制尚不明確，后期我們將從臨床研究出發進行驗證與深入探討。

參·考·文·獻

[1] Ford AC, Paul M, Hanauer SB. 譚蓓, 譯. 潰瘍性結腸炎[J]. 英國醫學雜志中文版, 2017, 20(7): 387-392.

[2] Baumgart DC, Sandborn WJ. Inflammatory bowel disease: clinical aspects and established and evolving therapies[J]. Lancet, 2007, 369(9573): 1641-1657.

[3] Stawowczyk E, Kawalec P. A systematic review of the cost-effectiveness of biologics for ulcerative colitis[J]. Pharmacoeconomics, 2018, 36(4): 419-434.

[4] 孫健, 高文艷, 林一帆. 潰瘍性結腸炎病因和發病機制研究進展[J]. 遼寧中醫藥大學學報, 2017, 19(4): 94-97.

[5] 周海新, 方健松, 張濤, 等. miR-21 介導腸上皮細胞凋亡維持腸道穩態參與潰瘍性結腸炎相關癌變研究[J]. 安徽醫科大學學報, 2017, 52(4): 523-527.

[6] 夏守兵, 許春杰, 蔣春暉, 等. 潰瘍性結腸炎及其惡性并發癥的生物信息學分析和潛在治療藥物篩選[J]. 上海交通大學學報（醫學版）, 2020, 40(3): 317-325.

[7] Chen WX, Ren LH, Shi RH. Implication of miRNAs for inflammatory bowel disease treatment: systematic review[J]. World J Gastrointest Pathophysiol, 2014, 5(2): 63-70.

[8] Zhang G, Wan Y, Zhang Y, et al. Expression of mitochondria-associated genes (PPARGC1A, NRF-1, BCL-2 and BAX) in follicular development and atresia of goat ovaries[J]. Reprod Domest Anim, 2015, 50(3): 465-473.

[9] Saxena S, Shukla S, Kakkar P. Berberine induced modulation of PHLPP2-Akt-MST1 kinase signaling is coupled with mitochondrial impairment and hepatoma cell death[J]. Toxicol Appl Pharmacol, 2018, 347: 92-103.

[10] 郝微微, 溫紅珠, 馬貴同, 等. 人參皂苷Rg1 對DSS 誘導潰瘍性結腸炎小鼠凝血功能的調節作用[J]. 中國中西醫結合消化雜志, 2013, 21(5): 238-242.

[11] 丁洋, 丁康, 譚妍妍, 等. 潰結改良方改善DSS 誘導的UC 小鼠腸道炎癥反應的機制研究[J]. 南京中醫藥大學學報, 2019, 35(3): 297-302.

[12] Geboes K, Riddell R, Ost A, et al. A reproducible grading scale for histological assessment of inflammation in ulcerative colitis[J]. Gut, 2000, 47(3): 404-409.

[13] 倪杰明. 腸黏膜屏障損傷在潰瘍性結腸炎的作用研究進展[J]. 安徽醫科大學學報, 2018, 53(5): 815-818.

[14] Sugawara R, Lee EJ, Jang MS, et al. Small intestinal eosinophils regulate Th17 cells by producing IL-1 receptor antagonist[J]. J Exp Med, 2016, 213(4): 555-567.

[15] Nigar S, Yamamoto Y, Okajima T, et al. Synergistic oligodeoxynucleotide strongly promotes CpG-induced interleukin-6 production[J]. BMC Immunol, 2017, 18(1): 44.

[16] Fischer S, Rath T, Geppert CI, et al. Long-term combination therapy with anti-TNF plus vedolizumab induces and maintains remission in therapy-refractory ulcerative colitis[J]. Am J Gastroenterol, 2017, 112(10): 1621-1623.

[17] 崔暢婉, 孫崢嶸. 潰瘍性結腸炎發病機制研究進展[J]. 現代免疫學, 2019, 39(1): 77-81.

[18] Paul P, Chakraborty A, Sarkar D, et al. Interplay between miRNAs and human diseases: a review[J]. J Cell Physiol, 2018, 233(3): 2007-2018.

[19] Jonas S, Izaurralde E. Towards a molecular understanding of microRNAmediated gene silencing[J]. Nat Rev Genet, 2015, 16(7): 421-433.

[20] Wang H, Chao K, Ng SC, et al. Pro-inflammatory miR-223 mediates the crosstalk between the IL23 pathway and the intestinal barrier in inflammatory bowel disease[J]. Genome Biol, 2016, 17: 58.

[21] He C, Yu T, Shi Y, et al. MicroRNA 301A promotes intestinal inflammation and colitis-associated cancer development by inhibiting BTG1[J]. Gastroenterology, 2017, 152(6): 1434-1448.e15.

[22] Feng J, Gao Q, Liu Q, et al. Integrated strategy of differentially expressed genes associated with ulcerative colitis[J]. Mol Med Rep, 2017, 16(5): 7479-7489.

[23] Polytarchou C, Oikonomopoulos A, Mahurkar S, et al. Assessment of circulating microRNAs for the diagnosis and disease activity evaluation in patients with ulcerative colitis by using the nanostring technology[J]. Inflamm Bowel Dis, 2015, 21(11): 2533-2539.

[24] 聶明月, 楊曉葵. miR-23a 和miR-27a 在卵巢中的生理和病理作用[J]. 國際生殖健康/計劃生育雜志, 2014, 33(5): 367-369.

[25] Wang QQ, Zhang LL, Yuan XD, et al. The relationship between the Bcl-2/Bax proteins and the mitochondria-mediated apoptosis pathway in the differentiation of adipose-derived stromal cells into neurons[J]. PLoS One, 2016, 11(10): e0163327.

[26] Wu F, Zikusoka M, Trindade A, et al. MicroRNAs are differentially expressed in ulcerative colitis and alter expression of macrophage inflammatory peptide-2α[J]. Gastroenterology, 2008, 135(5): 1624-1635.e24.