小分子代謝物在肺癌和肺炎鑒別診斷中的潛在作用

鄒 琛 ，徐潤灝 ，張 泓，馬 展，陳 黎，張 潔，李 敏，張舒林

1. 上海交通大學基礎醫學院免疫學與微生物學系，上海200025; 2. 上海交通大學附屬兒童醫院檢驗科，上海200062；3.上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院檢驗科，上海 200127

肺癌是我國發病率最高的惡性腫瘤之一，也是惡性腫瘤死因的首位[1]。早期診斷和及時治療是提高肺癌患者生存率的關鍵。隨著醫學影像學技術的發展，肺癌誤診率及漏診率大幅降低，但影像學檢查仍然有假陽性率高、過度診斷、輻射劑量超標等不足[2]。代謝組學是20 世紀末發展建立的一門學科，其研究對象大都是相對分子質量小于1 000 的小分子物質。體內代謝改變廣泛存在于腫瘤細胞與正常細胞間，以滿足腫瘤自身惡性增殖、侵襲、轉移和免疫逃逸的需要[3]。已有研究[4-6]證明，血清醛、酮、醇、氨基酸等人體代謝產物在肺癌患者和健康人群中有著顯著差異，但有關其診斷效能的研究還較少。本研究通過應用代謝組學技術對肺癌和肺炎患者血清小分子代謝產物進行探索，建立、優化診斷模型，尋找快速高效的肺癌和肺炎鑒別診斷的新方法。

1 對象與方法

1.1 研究對象

納入2018 年4—12 月于上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院就診的肺癌組患者95 例和肺炎組患者69 例，醫院體檢中心健康人群90 例為健康對照組。納入標準：肺癌組患者均已通過組織病理學檢查確診，且未發現肝腸轉移。肺炎組患者均已排除肺癌可能。肺癌組和肺炎組患者均未并發肝功能異常、腸道炎癥、膽囊結石，且未服用免疫抑制劑及氨基酸類藥物。健康對照組胃腸道功能未見異常，排除高血壓、糖尿病、慢性肝膽疾病及肝腎功能異常。研究獲得醫院倫理委員會通過，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 樣本前處理 采用含促凝劑的真空采血管，收集空腹靜脈血4 mL，16 169×g 離心10 min，2h 內分離血清。在24 h 內進行檢測的樣本冷藏（2 ～8 ℃）保存，24 h 內無法測定的樣本冷凍（-20 ℃及以下）保存。

1.2.2 氨基酸代謝譜檢測 采用API3200MD 三重四級桿質譜儀（美國ABSciex 公司）、Shimadzu 系列液相色譜儀（日本島津公司）檢測。氨基酸代謝譜分析試劑盒（上海可力梅塔生物醫藥科技有限公司），可檢測丙氨酸、精氨酸、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、亮氨酸、賴氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、纈氨酸、鳥氨酸、瓜氨酸。

分析樣品處理：分離血清。取10 μL 待測樣本于EP 管中，加入40 μL 氨基酸樣本稀釋液，震蕩混勻（10.06×g，5 min）。50℃氮氣吹干；加入復溶液100 μL 至96 孔板內，震蕩混勻（0.81×g，5 min）。

分析方法：高效液相色譜- 串聯質譜法（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）。色譜條件：分析柱為ACE Excel3AQ（3.0 mm×100 mm；美國Waters 公司）；流動相A 為水，流動相B 為甲醇（HPLC 級，MERCK 公司）。梯度洗脫；總分析時間為13 min；流速為0.5 mL/min；進樣量為8 μL。質譜條件：電噴霧離子源，負離子掃描，霧化氣壓力為40 psi，輔助加熱器壓力為60 psi，氣簾氣壓力為20 psi，碰撞氣壓力為6 psi，離子源電壓為-4 500V，離子源溫度為600 ℃。MRM 掃描分析。

1.2.3 膽汁酸代謝譜檢測 采用API3200MD 三重四級桿質譜儀（美國ABSciex 公司）、Shimadzu 系列液相色譜儀（日本島津公司）檢測。膽汁酸代謝譜分析試劑盒（上海可力梅塔生物醫藥科技有限公司），可檢測膽酸、鵝脫氧膽酸、甘氨膽酸、甘氨鵝脫氧膽酸、牛磺膽酸、?；蛆Z脫氧膽酸、脫氧膽酸、石膽酸、熊脫氧膽酸、甘氨脫氧膽酸、甘氨石膽酸、甘氨熊脫氧膽酸、牛磺脫氧膽酸、?；鞘懰?、?；切苊撗跄懰帷?/p>

分析樣品處理：取血清樣本100 μL，加入含內標的提取液500 μL，渦旋混勻（12.58×g，5 min）；離心（16 169×g，10 min）；取上清液400 μL 于96 孔板中，60 ℃氮氣吹干；加入復溶液100 μL，將96 孔板放置在微孔板恒溫振蕩器中混勻（1.10×g，10 min），轉移96 孔板中的復溶液到專用過濾板中，過濾板下放置新的96 孔板，將過濾板及96 孔板一起放置于多管架自動平衡離心機中進行過濾，離心（2 810×g，1 min），收集濾液，上機進樣。

分析方法： LC-MS/MS。 色譜條件：分析柱為XbridgeC18（3.0 mm×50 mm，3.5 μm； 美國Waters 公司）；流動相A 為水，流動相B 為甲醇（HPLC 級，美國MERCK 公司）；梯度洗脫；總分析時間為13min；流速為0.5 mL/min；進樣量為8 μL。質譜條件：電噴霧離子源，負離子掃描，霧化氣壓力為40 psi，輔助加熱器壓力為60 psi，氣簾氣壓力為20 psi，碰撞氣壓力為6 psi，離子源電壓為-4 500 V，離子源溫度為600 ℃；MRM 掃描分析。

1.3 統計學方法

采用SPSS 22.0 軟件進行統計分析。采用K-S 檢驗對數據進行正態性分布檢驗；正態性分布的定量數據以x—±s表示，組間比較采用獨立樣本t 檢驗；非正態分布的定性數據以M（Q1，Q3）表示，組間比較采用Mann-Whitney U 檢驗；采用逐步法二元Logistic 回歸進行相關性分析；根據Logistic 回歸結果，以訓練樣本建立初步診斷模型，并以考核樣本對診斷模型加以驗證，驗證通過后將訓練樣本和考核樣本合并，建立最終診斷模型；以診斷概率Y1為新變量，作ROC 曲線并分析模型診斷性能。P<0.01 為差異有顯著統計學意義。

2 結果

肺癌組95 例，其中男性63 例，女性32 例，年齡范圍為34 ～83 歲；肺炎組69 例，其中男性38 例，女性31例，年齡范圍為24 ～82 歲；對照組90 例，其中男性52例，女性38 例，年齡范圍為41 ～81 歲。

2.1 3 組間血清氨基酸代謝譜的比較

3 組間血清氨基酸比較結果見表1。肺炎組血清丙氨酸、組氨酸、賴氨酸均顯著降低（均P=0.000），苯丙氨酸顯著增高（P=0.000）；肺癌組血清丙氨酸、谷氨酸、組氨酸、亮氨酸、賴氨酸、纈氨酸均顯著降低（P=0.003；P=0.000； P=0.000；P=0.000；P=0.000；P=0.000）， 瓜氨酸、鳥氨酸顯著增高（P=0.009；P=0.000）。5 種氨基酸在肺炎組和肺癌組間差異有統計學意義，其中精氨酸、亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸在肺癌組中顯著低于肺炎組（P=0.001；P=0.001；P=0.009；P=0.000），瓜氨酸在肺癌組中顯著高于肺炎組（P=0.001）。

表1 3 組間血清氨基酸代謝譜比較（μmol/L）Tab 1 Comparison of amino acid metabolism spectrum among 3 groups (μmol/L)

2.2 3 組間血清膽汁酸代謝譜的比較

3 組間血清膽汁酸比較結果見表2。肺炎組血清脫氧膽酸、石膽酸、熊脫氧膽酸、甘氨脫氧膽酸、甘氨石膽酸、?；敲撗跄懰?、牛磺石膽酸等7 種膽汁酸顯著降低（P=0.000；P=0.000；P=0.000；P=0.000；P=0.000；P=0.000；P=0.001），甘氨鵝脫氧膽酸、?；蛆Z脫氧膽酸2 種膽汁酸顯著增高（P=0.003；P=0.003）；肺癌組血清脫氧膽酸、牛磺脫氧膽酸2 種膽汁酸顯著降低（P=0.005；P=0.000），膽酸、鵝脫氧膽酸、甘氨鵝脫氧膽酸、?；蛆Z脫氧膽酸4 種膽汁酸顯著增高（P=0.004；P=0.005；P=0.001；P=0.008）。

膽酸、鵝脫氧膽酸、脫氧膽酸、石膽酸、熊脫氧膽酸、甘氨脫氧膽酸、甘氨石膽酸7 種膽汁酸在肺炎組和肺癌組間比較差異有顯著統計學意義（P=0.000； P=0.000；P=0.000；P=0.000；P=0.000；P=0.000；P=0.002）， 其在肺癌組中均顯著高于肺炎組。

表2 3 組間血清膽汁酸代謝譜比較（μmol/L）Tab 2 Comparison of bile acid metabolism spectrum among 3 groups (μmol/L)

2.3 氨基酸代謝譜與膽汁酸代謝譜對肺炎和肺癌的診斷效能

對在肺炎組和肺癌組中差異有顯著統計學意義的5種氨基酸和7 種膽汁酸進行ROC 曲線分析（表3），結果顯示：脫氧膽酸、熊脫氧膽酸、苯丙氨酸有一定的診斷價值（AUC ≥0.7），其余代謝產物的診斷價值一般（0.5 ≤AUC<0.7）。12 個代謝物中，脫氧膽酸的敏感度和特異度均較高，且Youden 指數最高，是鑒別診斷能力最強的單個指標。

表3 5 種氨基酸和7 種膽汁酸的診斷效能分析Tab 3 Analysis of diagnostic efficiency of 5 amino acids and 7 bile acids

2.4 多種代謝物聯合運用建立診斷模型

2.4.1 建立初步診斷模型 隨機抽取90.0%的樣本，即62 例肺炎和85 例肺癌樣本組成訓練樣本。將在肺炎組和肺癌組中差異有顯著統計學意義的12 個代謝物（精氨酸、亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、瓜氨酸、膽酸、鵝脫氧膽酸、脫氧膽酸、石膽酸、熊脫氧膽酸、甘氨脫氧膽酸、甘氨石膽酸）納入逐步法二元Logistic 回歸分析（表4）。結果顯示瓜氨酸、苯丙氨酸、脫氧膽酸是鑒別診斷肺炎和肺癌的獨立影響因素。據此建立初步診斷模型： Y0=1/ （1+e-logit（P0））， 其 中logit（P0）=0.039× 瓜 氨酸-0.021×苯丙氨酸+0.005×脫氧膽酸+0.692，e 是一個自然常數，經模型系數綜合檢驗χ2=144.02，P<0.05；Hosmer-Lemeshow 檢驗χ2=4.52，P>0.05，顯示模型擬合度良好。根據ROC 曲線得出，該模型診斷最佳臨界值為0.55，此時氨基酸和膽汁酸聯合診斷肺炎的診斷效能最大，診斷靈敏度為76.5%，特異度為79.0%，在訓練樣本中共診斷成功49 例肺炎和65 例肺癌樣本，診斷符合率

77.6%。

表4 12 種代謝產物逐步法二元Logistic 回歸分析結果Tab 4 Analysis result of 12 metabolites by stepwise binary Logistic regression

2.4.2 驗證初步診斷模型 將剩余10.0%的樣本，即7例肺炎和10 例肺癌樣本組成考核樣本，代入模型Y 進行驗證，共診斷成功5 例肺炎和8 例肺癌樣本，診斷符合率76.5%，與訓練樣本的診斷符合率基本相同。

2.4.3 建立最終診斷模型 將訓練樣本和考核樣本合并后，再將上述12 個代謝物做逐步法二元Logistic 回歸分析，結果仍顯示瓜氨酸、苯丙氨酸、脫氧膽酸是鑒別診斷肺炎和肺癌的獨立影響因素。建立最終診斷模型： Y1=1/ （1+e-logit（P1））其中logit（P1）=0.037×瓜氨酸-0.027× 苯丙氨酸+0.004×脫氧膽酸+1.449。

2.4.4 分析最終診斷模型的診斷性能 以最終診斷模型診斷概率Y1為新變量作ROC 曲線分析，結果見圖1， 顯示曲線下面積（AUCROC） 為0.829（95%CI 0.762 ～0.883），最佳臨界值為0.55，此處診斷靈敏度為76.8%，特異度為79.7%，符合率為78.3%。

3 討論

圖1 診斷模型鑒別診斷肺癌和肺炎的ROC 曲線Fig 1 ROC of diagnostic model for differential diagnosis in lung cancer and pneumonia

原發性肺癌是最常見的惡性腫瘤，且其發病率有逐年增高的趨勢，及時準確地診斷肺癌直接影響患者的預后。目前有研究[7-8]顯示，影像學方法的肺癌誤診率仍超過50%，其中約有40%被誤診為肺炎?，F階段臨床采用的常用腫瘤標志物多為大分子蛋白，往往無法有效區分肺癌和肺炎[9]。不斷有研究[10-11]指出，小分子代謝物在診斷效能上更有優勢。隨著各種檢測技術，尤其是質譜技術的發展，使得精確測量小分子代謝物成為可能。因此，利用質譜和代謝組學方法檢測肺癌患者體內小分子代謝產物的差異，從而探索相關的生物標志物，在肺癌和肺炎鑒別診斷中具有重要的臨床價值。本研究利用質譜分析技術，集中對氨基酸譜和膽汁酸譜2 種類型的代謝物進行分析，尋找肺炎和肺癌患者中這2 類代謝產物的差異。

研究共檢測了11 種常見蛋白質氨基酸和2 種非蛋白質氨基酸，與對照組相比，肺炎組血清丙氨酸、組氨酸、賴氨酸顯著降低，苯丙氨酸顯著增高；肺癌組血清丙氨酸、谷氨酸、組氨酸、亮氨酸、賴氨酸、纈氨酸均顯著降低，瓜氨酸、鳥氨酸顯著增高，其中肺癌組中降低者均為蛋白質氨基酸，與Miyamoto 等[12]的研究結果一致。有報道[13-14]認為這是由于腫瘤增殖過程中，蛋白質及氨基酸被大量消耗，也有學者在血漿氨基酸譜的研究[15]中得出不同的結論，這可能由于血漿受EDTA 抗凝劑影響導致其部分組分的丟失或改變[16]。肺癌不僅影響人體的呼吸系統和循環系統，還會引起人體能量代謝的改變，導致機體氨基酸表達異常。在腫瘤患者體內，氨基酸為肺部腫瘤細胞的生長提供能量并構建其生長所需的蛋白質，并為腫瘤細胞在體內的免疫逃逸機制提供相應的功能[17]。氨基酸還能參與肺部腫瘤細胞調控的各個信號通路，參與細胞能量代謝相關信號通路的形成，從而控制細胞的生長和增殖 周期[18-19]。

膽汁酸是在肝細胞中合成初級膽汁酸，排入膽道后進入腸腔產生次級膽汁酸，并由肝門靜脈重吸收返回肝臟[20]。與氨基酸代謝相比，膽汁酸代謝常見于肝膽疾病和腸道疾病方面的研究，目前其與肺部疾病相關的報道很少。本研究對膽汁酸在肺炎和肺癌患者體內代謝的差異進行分析。肺炎組與對照組相比，血清脫氧膽酸、石膽酸、熊脫氧膽酸、甘氨脫氧膽酸、甘氨石膽酸、?；敲撗跄懰帷⑴；鞘懰? 種次級膽汁酸顯著降低，甘氨鵝脫氧膽酸、?；蛆Z脫氧膽酸2 種初級膽汁酸顯著增高；肺癌組血清脫氧膽酸、牛磺脫氧膽酸2 種次級膽汁酸顯著降低，膽酸、鵝脫氧膽酸、甘氨鵝脫氧膽酸、牛磺鵝脫氧膽酸4 種初級膽汁酸顯著增高。據文獻[21]報道，在肺炎患者體內，膽汁酸受體能通過抑制NF-κB 通路的激活而達到抑制炎癥的效果，脂多糖及某些促炎細胞因子也可誘導肺部膽汁酸受體下調，進入外周血的膽汁酸相應減少。在肺癌患者體內，肺組織內的膽汁酸受體能激活細胞周期蛋白-D1，促進肺部腫瘤的增長[22]，也能通過激活JAK2/STAT3 信號通路刺激肺部腫瘤細胞增殖[23]；隨著腫瘤的發生，肺癌患者的肺組織膽汁酸受體增多，進入外周血的膽汁酸相 應增多。

在了解肺癌和肺炎患者血清中相關代謝產物的變化和特征后，本研究對95 例肺癌患者、69 例肺炎患者和90例健康對照人群血清氨基酸和膽汁酸進行了比較，對其鑒別診斷效能進行綜合評估。12 種代謝物在肺炎組和肺癌組間差異有顯著統計學意義，其中精氨酸、亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸4 種氨基酸在肺癌組中低于肺炎組，膽酸、鵝脫氧膽酸、脫氧膽酸、石膽酸、熊脫氧膽酸、甘氨脫氧膽酸、甘氨石膽酸7 種膽汁酸和瓜氨酸在肺癌組中高于肺炎組。單個代謝產物診斷效能最好的是脫氧膽酸，其靈敏度為78.2%，特異度為71.1%，ROC 曲線下面積達到了0.768。為了評價上述12 項代謝產物的聯合診斷效能，我們將其納入Logistic 回歸方程并建立診斷模型，初步的模型及最終的模型均提示瓜氨酸、苯丙氨酸和脫氧膽酸是聯合診斷的最優組合。聯合診斷模型的ROC 曲線下面積為0.829，高于所有單項代謝產物，因此聯合診斷能提高相關代謝產物對肺癌和肺炎的診斷效能。同時，對模型的驗證也顯示，訓練樣本和考核樣本的診斷符合率基本相符，故該模型有一定的臨床價值，可以和常用的腫瘤標志物并結合影像學技術對肺癌和肺炎進行鑒別診斷。

本研究評價了13 種氨基酸和15 種膽汁酸及其聯合檢測對于鑒別肺炎和肺癌的臨床價值，發現小分子代謝物聯合檢測的診斷效能顯著高于單項分析指標。同時，聯合檢測的診斷效能也高于目前臨床常用的單項肺部腫瘤標志物，如癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、神經元烯醇化酶（nueron enolase，NSE）、鱗癌抗原（squamous cell carcinoma antigen，SCC）等，且小分子代謝產物聯合檢測的靈敏度高于肺部腫瘤標志物聯合檢測的靈敏度，但特異性稍有不如[24]。如果將小分子代謝產物和肺部腫瘤標志物聯合檢測，可能得到高于這二者對于肺炎和肺癌的鑒別診斷效能。

由于本研究尚未將全部氨基酸以及脂肪酸類、類固醇類等代謝物納入，因此本研究得出的診斷模型還需要進一步優化。隨著代謝組學的迅速發展，其在腫瘤的早期診斷、發生機制的探索、個體化治療方案的制定等方面將發揮重要作用。

參·考·文·獻

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