長鏈非編碼RNA AC073046.25 在系統性紅斑狼瘡易感基因TET3 表達調節中的作用

徐 寧，周 甜，侯國俊，沈 南，唐元家

上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院風濕病科，上海市風濕病學研究所，上海 200127

系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種復雜的自身免疫病，主要表現為自身抗體的分泌、Ⅰ型干擾素信號通路的異常活化[1]。有研究[2-3]發現，除了產生自身抗體的B 細胞外，單核/巨噬細胞、T 細胞、樹突狀細胞和中性粒細胞等均與SLE 密切相關。

長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一類長度在200 bp 以上的、不具有蛋白翻譯功能的RNA[4]。其曾被認為是沒有功能的轉錄組暗物質，但越來越多的研究[5-6]發現lncRNA 可在體內病理生理代謝反應中發揮重要的調控作用。不僅如此，lncRNA 還可以作為增強子RNA（enhancer RNA，eRNA）參與基因的表達調控。eRNA 常轉錄自基因編碼區以外的增強子區域[7]，以順式（cis-）或反式（trans-）調控作用參與基因表達[8-9]。由于eRNA 轉錄自增強子區域，故可根據增強子的表觀遺傳學修飾信號即組蛋白H3 第4 位賴氨酸單甲基化（H3K4me1）和組蛋白H3 第27 位賴氨酸乙酰化（H3K27ac）情況來鑒定lncRNA 是否存在增強子活性[10]。

Tet 甲基胞嘧啶雙加氧酶（Tet methylcytosine dioxygenase，Tet）是一類DNA 去甲基化酶，主要包括TET1、TET2 和TET3[11]。其中，TET1 可抑制非霍奇金淋巴瘤的增殖[12]，TET2 與白介素6（interleukin-6，IL-6）和Forkhead box 蛋白P3（forkhead boxprotein P3，FOXP3）的表達相關[13-14]，TET3 與胚胎發育和腫瘤發生相關[15-16]。另有報道[17]顯示，TET3 可作為負調控分子抑制干擾素β 的表達。全基因組關聯研究（Genome-wide association study，GWAS）[18]發現 TET3 是SLE 易感基因，提示其可能參與SLE 疾病的發展。但有關TET3 表達調控機制尚不清楚。根據Ensembl 數據庫中的基因注釋，我們發現在TET3 轉錄本的上游存在一條lncRNA AC073046.25，而已有報道[19-20]提示，編碼基因鄰近區域的lncRNA 可作為eRNA 調節基因的表達。故本研究從SLE 易感基因TET3 的表達調控出發，探究AC073046.25 與TET3 表達水平之間的關系，以及在SLE 患者和健康志愿者中AC073046.25 的表達差異，以期為SLE 的診斷提供一種新的生物標志物。

1 對象與方法

1.1 研究對象、試劑及儀器

1.1.1 試驗對象和細胞培養 選擇2018—2019 年于上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院風濕病科就診的SLE 患者46 例（均為女性），平均年齡（34.52±9.27）歲。所有患者均符合2009 年美國風濕病協會（American College of Rheumatology，ACR）頒布的SLE 診斷標準[21]。同時，招募與SLE 患者的年齡、性別分布相匹配的，無SLE 家族遺傳病史，無糖皮質激素攝入的健康志愿者32 名（健康對照組）。本研究已通過上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院倫理委員會審批（倫理審批號為【2013】126 號），所有被試均簽署了知情同意書。

本研究相關實驗中所用U-937 細胞為自組織淋巴瘤的單核細胞系，購自中國科學院細胞庫。在含有10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的1640 培養基中培養U-937 細胞，待生長密度達70%即可傳代。本實驗所用細胞為指數生長期的第3 ～9 代細胞，生長狀態良好。

1.1.2 試劑與儀器 RPMI-1640 培養基、FBS、Opti-MEM 無血清培養基（Gibco，美國），NE-PER 胞漿胞核分離試劑盒（Thermo，美國），人CD4+、CD8+、CD14+和CD19+細胞陽選分離磁珠（Miltenyi，德國），TRIzol試劑（Invitrogen，美國），PrimeScriptTM反轉錄試劑盒與TB Green?Premix Ex TaqTM熒光定量試劑盒（Takara，日本），ViiATM7 實時定量PCR 系統（Applied Biosystems，美國），TransIntroTMEL 轉染試劑（北京全式金生物技術有限公司），高速冷凍離心機（Eppendorf，德國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 AC073046.25 所在區域基因組的表觀遺傳學分析 本研究涉及的表觀遺傳學數據均來自RoadMap 數據庫（http://www.roadmapepigenomics.org/data/tables/all#），分析步驟如下：①點擊Browse Data 選項卡下的Data table 選項，選定免疫細胞亞群和組蛋白修飾類型。②點擊Go to Browser 按鈕，建立與UCSC 數據庫的鏈接，并輸入位置：GRCh37/hg19 chr2:74208245-74218245。③點擊View 選項下的PDF/PS 選項，將數據保存為后綴.EPS 的文件。④使用AI 圖像處理軟件，將與表觀遺傳修飾無關的部分刪除，只保留基因注釋和表觀遺傳修飾峰圖的數據即可。

表1 qPCR 引物序列Tab 1 Primer sequences for qPCR

1.2.3 ASO/siRNA 轉染 為驗證AC073046.25 mRNA 水平降低后對TET3 表達的影響，我們利用反義寡核苷酸（antisense oligonucleotide，ASO） 對AC073046.25 進行敲低。實驗步驟如下：于轉染前18 h，將U-937 細胞均勻接種于24 孔板中，每孔2×105個細胞。實驗分為陰性對照組（ASO-NC）和實驗組（AC073046.25-ASO1、AC073046.25-ASO2）；向50 μL Opti-MEM 無血清培養基中加入2 μL 100 mmol/L 的ASO，充分混勻后靜置3 min，再向其中加入2 μL TransIntroTMEL 轉染試劑，輕柔混勻后室溫靜置15 min，隨后將上述混合物緩慢滴加至U-937 上清液中培養6 h 后，離心收集細胞，使用TRIzol 抽提RNA，經反轉錄后行qPCR 檢測（引物見表1）。為驗證TET3 mRNA 水平降低是否會對AC073046.25 產生影響，我們還利用小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）對TET3 進行敲低。在siRNA 轉染實驗中，分為陰性對照組（siRNA negative control，siRNA-NC）和實驗組（siRNA-TET3），除需將2 μL的ASO 替換為2 μL 20 mmol/L 的siRNA 外，其余步驟均與ASO 轉染實驗一致。ASO 及siRNA 的轉染序列如表2。

表2 ASO 及siRNA 轉染序列Tab 2 Transfection sequences of ASO and siRNA

1.2.4 不同原代免疫細胞亞群的分離 收集健康志愿者和SLE 患者的外周血樣本，分別通過密度梯度離心法將2 個樣本中的單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）進行分離，步驟如下：將所得樣本用含有2%牛血清白蛋白與2 mmol/L 乙二胺四乙酸的PBS（即美天旎緩沖液）稀釋2 倍。向50 mL 離心管中加入密度梯度離心介質Ficoll 15 mL，并將稀釋后的外周血樣本沿管壁緩慢加至Ficoll 液面上方，設置離心機加減速度為零，400×g 離心45 min 后吸取位于Ficoll 與水相之間的PBMCs。對該細胞進行計數后，用美天旎緩沖液洗滌2次，按CD14+/CD4+/CD8+/CD19+磁珠使用說明書進行相應免疫細胞亞群的分離。

1.2.5 RNA 測序 采用TRIzol 抽提從上述方法中獲得的健康志愿者的免疫細胞亞群的RNA，并送至蘇州金唯智公司進行RNA-seq 測序，包括對原始數據進行質控和分析。目前，常采用2 種衡量標準對轉錄本的表達水平進行分析：即每百萬個映射的讀數中映射到外顯子的每一千個堿基上的讀數個數（fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments，FPKM）和每百萬個外顯子模型讀數中映射到轉錄本每千個堿基的個數（transcripts per kilobase of exon model per million mapped reads，TPM）。由于TPM 可以更精確地反映轉錄本的表達水平，因此本研究采用TPM 作為衡量AC073046.25 在不同免疫細胞亞群中表達水平的依據。

1.2.6 SLE 患者疾病活動度評分 采用系統性紅斑狼瘡疾病活動指數（systemic lupus erythematosus disease activity index，SLEDAI）對SLE 患者的疾病活動程度進行評分，并據此將患者分為疾病活躍組（SLEDAI>4 分）與疾病穩定組（SLEDAI ≤4 分）。

1.3 統計學方法

采用GraphPad Prism 7.0 軟件對研究數據進行統計分析。通過計算皮爾遜相關系數，分析健康志愿者與SLE患者的原代單核細胞中AC073046.25 與TET3 表達水平之間的相關性。通過非配對雙側Student's t 檢驗，比較健康志愿者、疾病活躍組與疾病穩定組間AC073046.25與TET3 表達水平的差異。P<0.05 表示差異具有統計學 意義。

2 結果

2.1 LncRNA AC073046.25 對TET3 的表達調節作用

由于TET3 上游存在一條與之同向的lncRNA，從空間上來說，我們認為該lncRNA 存在調控TET3 表達的可能性。因此，本研究首先對該lncRNA 所在區域的表觀遺傳修飾進行分析，結果（圖1A）顯示在CD14+單核細胞中的AC073046.25 位點處探測到了較強的H3K4me1 與H3K27ac 信號；而結合原代不同免疫細胞亞群的RNA-seq數據（圖1B）可以發現，AC073046.25 在單核細胞中表達水平較高，繼而推斷該lncRNA 有可能在CD14+的單核細胞中發揮功能。

由于eRNA 參與基因轉錄水平調控，因此其主要定位于細胞核。本研究采用胞漿胞質分離實驗對AC073046.25的定位進行探究，隨后經qPCR 檢測（圖1C）顯示，在U-937 細胞中AC073046.25 主要定位在細胞核內（84.8%的AC073046.25 分布于細胞核內，僅有15.2%分布在 胞漿）。

圖1 LncRNA AC073046.25 的功能性預測Fig 1 Functional prediction of lncRNA AC073046.25

為進一步驗證AC073046.25 的功能，我們在U-937細胞中設計功能缺失實驗，即用ASO 對AC073046.25進行敲低，并通過qPCR 對敲低效率及敲低后對TET3的表達影響進行分析。結果（圖2A、2B）顯示，與ASO-NC 組相比，ASO 實驗組可在RNA 水平有效敲低AC073046.25， 效率均>50%（ASO1：P=0.008，ASO2：P=0.010）；同時該實驗組在敲低AC073046.25 后，TET3 mRNA 水平降低（均P=0.002）。繼而說明，在U-937 細胞中AC073046.25 對TET3 的表達存在調控作用。而通過siRNA 將TET3 在mRNA 水平上進行敲低后結果（圖2C、2D）發現，siRNA 敲低TET3（P=0.008）并未影響AC073046.25 的表達。基于上述結果，我們認為在U-937細胞中AC073046.25 對TET3 的表達存在調控作用，且該調控作用是單向的。

圖2 siRNA/ASO 轉染U-937 細胞后，qPCR 檢測AC073046.25 和TET3 的表達水平Fig 2 After siRNA/ASO was transfected into U-937 cells, the expression levels of AC073046.25 and TET3 were detected by qPCR

2.2 AC073046.25 與TET3 在原代單核細胞中的表達相關性分析

在確定了AC073046.25 在U-937 細胞中對TET3 存在表達調控作用后，我們采用qPCR 檢測單核細胞中AC073046.25 與TET3 的表達水平，并在GraphPad Prism 軟件中計算皮爾遜系數對二者表達水平作相關性分析；其中，X 軸AC073046.25 表達量為自變量，Y 軸TET3 表達量為因變量。結果（圖3）顯示，在原代單核細胞中AC073046.25與TET3 的表達水平間存在正相關性（r=0.650，P=0.000）。

2.3 AC073046.25 在不同疾病活動度SLE 患者單核細胞中的表達水平分析

圖3 原代單核細胞中AC073046.25 與TET3 表達的相關性分析Fig 3 Correlation analysis of AC073046.25 and TET3 expression in primary monocytes

雖經分析得知，在原代單核細胞中AC073046.25 與TET3 的表達呈正相關，但我們仍需對AC073046.25 與SLE間的關系做進一步驗證。通過對46 例SLE 患者的疾病活動情況打分并統計，結果發現疾病穩定組共25 例、疾病活躍組共21 例。采用qPCR 對健康對照組、疾病穩定組和疾病活躍組的單核細胞中AC073046.25 和TET3 表達水平進行分析，結果（圖4）所示，AC073046.25 在健康對照組與疾病穩定組的表達水平間差異無統計學意義，在疾病活躍組則較低（P=0.002，P=0.000）；與健康對照組相比，TET3在疾病活躍組中的表達水平則表現為下調（P=0.010）。

圖4 AC073046.25 及TET3 在健康對照組及不同疾病活動組的單核細胞中的表達Fig 4 Expression of AC073046.25 and TET3 in monocytes derived from healthy control group and different disease activity groups

3 討論

本研究結果顯示，在U-937 細胞中通過ASO 敲低AC073046.25 會導致TET3 表達水平的降低；且在原代單核細胞中，AC073046.25 與TET3 的表達水平呈正相關。由此我們認為，該AC073046.25 在單核細胞中能夠調控TET3的表達。隨后我們對不同疾病活動組的SLE 患者單核細胞中AC073046.25 的表達水平進行分析，結果發現疾病活躍組中的AC073046.25 表達水平顯著低于健康對照組與疾病穩定組。因此，我們認為該lncRNA 具備作為活躍性SLE診斷的生物標志物的潛力，與報道[22]結論一致。

lncRNA 曾因不具備編碼蛋白質的能力而被視為無用的轉錄產物。但隨著高通量測序技術水平的不斷提升，越來越多的lncRNA 被發現，其功能也逐漸被報道[23]。根據研究結果，我們認為AC073046.25 可能以eRNA 的形式參與TET3 的表達調控。且eRNA 在轉錄水平對靶基因的調控方式可大致分為2 種：通過募集組蛋白修飾相關的酶來改變組蛋白的修飾水平，影響染色質開放性[24]；或是與蛋白或RNA 結合來影響其穩定性，參與轉錄調控[25]。針對AC073046.25 具體發揮功能的機制探索，我們計劃從以下幾個角度開展：首先通過生物信息學對有可能與其直接結合的轉錄因子進行預測，其次是通過RNA 拉下（RNA pull down）合成生物素標記的AC073046.25 探針，將與之結合的蛋白質拉下，并通過質譜對這些蛋白質進行鑒定[26]；除此之外，我們還計劃采用環形染色質構象捕獲（Circular chromosome conformation capture，4C）實驗來驗證AC073046.25 可通過誘導增強子-啟動子環形染色體構象的形成來調控TET3 的表達[27]。綜上，通過研究AC073046.25 對TET3 的表達調控具體機制，不僅可以為其作為活躍性SLE 的診斷標志物提供堅實的理論基礎，還可以為SLE 的治療提供新的靶點，值得進一步深入 分析。

參·考·文·獻

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