豬流行性腹瀉病毒鄒平分離株S1基因的遺傳進化分析

李天芝，于新友，李 峰

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫研究院，山東 濱州 256600）

豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea,PED）是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的一種急性接觸性腸道傳染病[1]。主要表現為水樣腹瀉、嘔吐，7日齡內仔豬死亡率可達100%。PED以糞-口水平途徑傳播為主，是危害養豬場最嚴重的疾病之一，傳播速度快，短時間內豬場可反復發病。2010年冬季，PED在我國大面積暴發[2]，毒株由傳統G1型變為G2型，病毒毒力增強，對哺乳仔豬危害嚴重。自2013年美國暴發PED，PED在全球范圍廣泛流行，且流行毒株主要以G2型變異毒株為主。

PEDV屬于冠狀病毒科甲型冠狀病毒屬，基因組為單股正鏈RNA病毒，大小約28 kb，包含5′非翻譯區、3′非翻譯區，7個開放閱讀框，編碼復制酶多聚蛋白 1ab、纖突蛋白（S）、小膜蛋白（E）、膜糖蛋白（M）和核衣殼蛋白（N）等多種不同蛋白[3]。其中S蛋白是與病毒入侵宿主細胞緊密相關一種糖蛋白，S蛋白被剪切為S1和S2兩個亞基。S1亞基與受體的結合有關，也是誘導產生中和性抗體的主要區域，氨基酸的插入和缺失也主要發生在這一區域。S1基因在遺傳進化上具有較高的變異性[4]，毒株變異情況可通過對S1基因變異分析獲得。根據S1基因序列差異PEDV可分為G1經典毒株和G2變異毒株兩個大的進化分支，其中G1又可分為兩個進化亞支G1a和 G1b，G2可分為 3個進化亞支 G2a、G2b和G2c，當前主要流行毒株為G2b毒株[5]。本研究對鄒平某豬場疑似PEDV感染腸道內容物樣本檢測，經RT-PCR擴增S1基因序列、測序，并與GenBank公布基因序列進行比對分析，旨在了解鄒平豬場PEDV最新流行毒株變異情況，為疾病防控奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 病料

病料為2020年4月采自山東鄒平某規模豬場疑似PEDV感染的豬腸道及內容物等。

1.2 試劑及試劑盒

Axy Prep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒購自愛思進生物技術（杭州）有限公司，豬流行性腹瀉病毒核酸熒光RT-PCR檢測試劑盒由山東綠都生物科技有限公司動物疫病檢測事業部研制，pMD18-T vector、Prime ScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2 等購自寶生物工程（大連）有限公司，DL 2 000 Marker、多功能DNA純化回收試劑盒、高純質粒小量制備試劑盒購自北京百泰克生物科技有限公司，其它化學試劑如異丙醇、乙醇等，均為國產分析純產品。

1.3 引物合成

應用DNAStar軟件對GenBank中收錄的PEDV S1基因比對分析，并利用Primer Premier 5.0軟件設計1對特異性引物，預期擴增目的基因片段大小為2 257 bp，引物序列為 F：5′-CTACCACAAGATGTCA CCAGGT-3′，R：5′-GGCCAGACTGAGATGGGACGTA G-3′，引物由通用生物系統（安徽）有限公司合成。

1.4 病料樣品檢測

采集水樣糞便或取糊狀糞便加適量生理鹽水稀釋，12 000 r/min離心5 min，取上清液，按照Axy Prep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒說明書提取病毒核酸樣品。按豬流行性腹瀉病毒核酸熒光RTPCR檢測試劑盒說明書對制備的核酸進行檢測。

1.5 PEDV S1基因序列擴增

首先用無核酸酶滅菌純化水分別稀釋引物F和R，使得其終濃度均10 μmol/L，隨后，以提取的PEDV核酸RNA為模板，進行RT-PCR反應。按照One Step RT-PCR Kit Ver.2說明書進行反應體系的配制，總體系 25 μL，其中 2×1 Step Buffer 12.5 μL，Prime ScriptTM1 step Enzyme Mix 1.0 μL，F 1.0 μL，R 1.0 μL，模板量 2.5 μL，滅菌純化水 8.0 μL 瞬時離心后，放入PCR儀進行擴增反應。擴增反應程序為：50℃反轉錄30 min；95℃預變性2 min；95℃變性40 s，53 ℃退火50 s，72 ℃延伸 2 min。

1.6 PCR擴增產物的檢測及序列比對分析

取PCR產物電泳檢測，觀察擴增結果，切下目的條帶，按照DNA凝膠回收試劑盒的說明書操作進行回收。回收產物與pMD18-T連接，轉化感受態大腸桿菌DH5α，37℃過夜培養后，挑取單菌落搖菌過夜，按質粒提取試劑盒的說明書抽提培養菌液的質粒，送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。將測序結果與GenBank中參照的PEDV S1基因序列進行比對分析。

2 結果

2.1 病原檢測結果

以提取的病毒核酸為模板，進行PEDV熒光RT-PCR檢測，結果顯示，導致豬場仔豬腹瀉的病原為PEDV。

2.2 PEDV S1基因擴增產物的檢測

用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，結果在2 257 bp左右出現擴增DNA條帶（圖1），和預期大小一致。

2.3 PEDV S1基因測序及序列分析

測序結果顯示，PEDV鄒平分離株S1基因大小為2 257 bp。從GenBank中下載PEDV各進化分支不同代表毒株，用DNAStar軟件進行分析，構建進化樹（圖2），結果顯示，分離毒株在PEDV G2b分支。PEDV鄒平分離株與G1分支參考毒株核苷酸同源性為89.5%～92.2%，與G2分支參考毒株核苷酸同源性為94.7%～98.7%，與經典疫苗毒株CV777核苷酸同源性僅為89.7%。與韓國和日本經典疫苗毒株DR13和83P-5核苷酸同源性為89.8%和89.7%。PEDV鄒平分離株S1基因推導其氨基酸與疫苗株CV777相比存在5個氨基酸（58～59位之間插入氨基酸QGVN）的插入和2個氨基酸的缺失（158～159位缺失氨基酸（DG）。

3 討論

我國于1976年有流行性腹瀉病例的相關報道，并于1982年實現了PEDV在腸組織原代單層細胞上傳代培養。PEDV首次出現后在我國豬場一直持續存在，但對豬的危害并不是特別嚴重，主要為大豬一過性腹瀉，采用經典CV777毒株制備疫苗，豬場PED得到很好的控制。自2010年開始，PEDV病毒發生變異，毒株毒力增強，迅速蔓延全國大部分豬場，哺乳仔豬死亡率高達100%，豬場損失嚴重。

2020年4月鄒平某規模豬場哺乳仔豬發生腹瀉，死亡率較高，通過臨床表現和剖檢病變疑似發生豬流行性腹瀉，采集病料送實驗室進行豬流行性腹瀉病毒熒光RT-PCR檢測，結果確診為PED。PEDV基因組遺傳衍化分析顯示，S1基因為高變區，其變異在一定程度上代表了整個基因組的變異特征，S1基因是PEDV關鍵毒力基因，含有的中和抗原表位，不同毒株S1基因的插入、缺失會間接導致病毒毒力和免疫原性等一系列改變[6]，自2010年以后PEDV流行毒株由經典的G1型變為變異型G2型，G1經典毒株進化亞支G1a主要是弱毒疫苗株及其衍生毒株，G1b主要是傳統意義上認為的田間流行經典野毒株。G2變異毒株進化亞支G2a主要是 2010—2013年分離毒株，G2b主要是 2016—2019年分離的流行毒株，也是當前主要流行毒株，G2c亞支則為重組毒株。為了解豬場PEDV流行毒株變異情況，對PEDV鄒平株S1基因進行克隆測序，并用DNAMan軟件進行遺傳進化分析，以了解豬場流行毒株的S1基因遺傳變異特點，旨在為豬場PEDV疫苗的選擇提供一定參考依據。本研究所獲得的PEDV鄒平株序列則屬于G2b進化分支，這對于鄒平地區PED的分子流行病學監測和防控具有重要意義。

豬流行性腹瀉無有效藥物治療，只能以疫苗預防為主，然而免疫接種經典PEDV毒株疫苗的豬場也常有PED發病，推測由于PEDV流行毒株發生變異，傳統基因型疫苗毒株防控效果不理想所致，因此，選擇當前流行毒株制備疫苗是防控PED的關鍵。豬場發病后除緊急接種適宜毒株疫苗外，還應該加強飼養管理，飼喂全價配合飼料，保證豬舍適宜的溫度和濕度，飲水清潔衛生，定期清理衛生，加強消毒，無害化處理病死豬，開展滅蚊蠅滅鼠工作，做好后備豬馴化及常規疫苗免疫接種工作等綜合性防控措施。