我國豬瘟疫苗研究與應用進展

李 嬌，祖立闖，王文秀，謝金文，沈志強，

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫研究院，濱州 256600）

豬瘟（Classical swine fever,CSF）是由豬瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）引起豬的一種高度接觸性、致死性的傳染病，長期以來我國通過采取以疫苗免疫接種為主，結合抗體監測、生物安全等綜合性防控措施有效防止了豬瘟的大規模暴發和流行[1-2]。隨著全球范圍內豬瘟凈化工作的不斷開展，部分歐洲和美洲國家已經徹底消滅了豬瘟，這對我國凈化豬瘟具有重要的借鑒和指導意義。目前，我國商品化的豬瘟疫苗主要是基于中國豬瘟兔化弱毒株（C株）的系列弱毒疫苗，但該類疫苗均無法區分自然感染豬和疫苗接種豬，這種技術上的不足在很大程度上限制了我國豬瘟凈化工作的開展，已經無法滿足我國豬瘟凈化的需要[3]。研制新型、安全、高效和能夠區分疫苗免疫接種動物和野毒感染動物的新型標記疫苗逐步成為豬瘟防控領域的研究重點，且我國研究學者在豬瘟新型標記疫苗研究領域已經取得了一些重要進展。本文綜述了我國豬瘟滅活疫苗、弱毒疫苗等常規商品化疫苗的應用現狀以及亞單位疫苗、核酸疫苗、活載體疫苗、合成肽疫苗、全長感染性cDNA標記疫苗等新型疫苗方面的研究進展，為新形勢下進一步開展豬瘟疫苗的研發提供借鑒與參考，對我國豬瘟的綜合防控具有一定的參考價值。

1 商品化疫苗

1.1 傳統滅活疫苗

自豬瘟病毒流行以來，人們就一直嘗試采用各種免疫方法對其進行預防和控制。最開始使用高免血清來免疫豬群，但存在高免血清獲得困難并且存在較大散毒風險等缺點。隨后，研究學者陸續開展滅活疫苗研究，其中以結晶紫滅活疫苗的推廣應用最為廣泛，在當時歷史條件下為全球范圍內豬瘟的防控做出了不可估量的貢獻。滅活疫苗雖然安全，但利用組織培養的病毒效價較低，疫苗保護力不足，防治效果有限，限制了該類疫苗的發展。隨著現代生物技術和生物制品產業的快速發展，這些初級豬瘟疫苗現已退出了市場。

1.2 弱毒疫苗

我國研究學者在20世紀50年代將豬瘟強毒在兔體內進行連續傳代后獲得豬瘟病毒兔化弱毒疫苗（HCLV）又稱“C株”，該弱毒疫苗株具有安全、免疫保護力好、能夠針對不同的豬瘟野毒株產生免疫保護力、遺傳特性十分穩定等優點，于1956年開始推廣使用，對世界范圍內預防和控制豬瘟流行發揮了重要作用。弱毒疫苗可同時誘導較強的細胞免疫反應和體液免疫反應，產生良好的免疫保護效果，與滅活疫苗相比具有使用劑量小、免疫原性好、不需佐劑、產生免疫快、抗體持久、成本低、使用方便等優點。目前我國使用的商品化弱毒疫苗有兔源脾淋源豬瘟活疫苗、細胞源豬瘟活疫苗、傳代細胞源豬瘟活疫苗、豬瘟-豬丹毒-豬多殺性巴氏桿菌病三聯活疫苗、豬瘟-高致病性豬繁殖與呼吸綜合征二聯活疫苗。

1.2.1 兔源脾淋源豬瘟活疫苗 該類疫苗是通過將豬瘟兔化弱毒株接種成年家兔，挑選感染定型熱的家兔，經無菌采集其脾臟和淋巴結進行碾磨、冷凍干燥制備而成，其優點是免疫原性強，接種后免疫效果好，抗體產生速度快，持續時間較長，同時該疫苗中含有某些免疫相關因子，能起免疫增強劑的作用。其缺點是在生產過程中需要活體動物，疫苗生產的成本較高，也不符合動物福利。目前市場上所使用的該類疫苗有豬瘟活疫苗（兔源）、政府采購專用豬瘟活疫苗（脾淋源）、豬瘟耐熱保護劑活疫苗（兔源）。其中耐熱保護劑類疫苗解決了常規弱毒疫苗對保存和運輸條件要求高，不利于長途運輸等缺點，該疫苗可以長時間在4℃的環境中保存和運輸，極大地方便了疫苗產品的推廣與應用，降低了產品質量因保存條件不佳而失效的幾率，從而保障產品質量更加穩定。

1.2.2 細胞源豬瘟活疫苗 該類疫苗是通過將豬瘟兔化弱毒株接種于犢牛睪丸細胞中進行培養，收獲細胞培養物，冷凍干燥后制成，目前市場上所使用的該類疫苗有豬瘟活疫苗（細胞源）、政府采購專用豬瘟活疫苗（細胞源）、豬瘟耐熱保護劑活疫苗（細胞源）。該類疫苗具有生產成本低、生產量大，生產過程容易監控等優點，但該類疫苗生產時需要使用異源原代細胞培養，產品批間差異較大，且存在牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）污染的威脅。

1.2.3 傳代細胞源豬瘟活疫苗 該類疫苗是通過將豬瘟弱毒株接種于豬睪丸傳代細胞（ST細胞）中進行培養，將細胞培養物冷凍干燥而成，目前市場上所使用的該類疫苗有豬瘟活疫苗（傳代細胞源）。該類疫苗是使用ST傳代細胞系進行培養，在生產過程中其批量間差異較小，穩定性較好，可以連續大批量生產，生產過程容易監控，且避免了BVDV的干擾，更重要的是該類疫苗能保證接種豬只在母源抗體的干擾下仍能獲得較理想的抗體水平，是目前豬瘟弱毒疫苗中最先進、使用最廣泛的疫苗。

1.2.4 豬瘟-豬丹毒-豬多殺性巴氏桿菌病三聯活疫苗 該類疫苗是通過將豬瘟兔化弱毒株接種乳兔或易感細胞，收獲含毒乳兔組織或細胞培養病毒液，以適當比例和豬丹毒桿菌弱毒菌液、豬源多殺性巴氏桿菌弱毒菌液混合，經冷凍干燥制成，可同時用于預防豬瘟、豬丹毒、豬多殺性巴氏桿菌病。由于一般豬瘟疫苗在生產過程中含有雙抗，而雙抗對豬丹毒桿菌和豬肺疫桿菌具有明顯的抑制作用，因此配置三聯苗必須應用不含雙抗的豬瘟乳兔組織或細胞培養物，對豬瘟疫苗的生產工藝提出了更高要求。

1.2.5 豬瘟-高致病性豬繁殖與呼吸綜合征二聯活疫苗 目前我國市場上商品化的該類疫苗只有高致病性豬繁殖與呼吸綜合征、豬瘟二聯活疫苗（TJMF92株+C株），該疫苗是通過將高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒TJM-F92弱毒株與豬瘟病毒兔化弱毒C株分別接種Marc145細胞和牛睪丸（BT）傳代細胞培養，收獲細胞培養物后按適當比例混合，加耐熱保護劑，經冷凍真空干燥制成。該疫苗使用耐熱保護劑，可在2～8℃保存18個月，“兩病同防”，一針解決豬瘟、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征兩大豬病，簡化免疫程序，減少對仔豬的應激，降低人力成本。同時，該二聯疫苗在豬瘟疫苗效力檢驗方面，采用免疫熒光定量技術（FAID50）替代了傳統豬瘟弱毒疫苗一直沿用的兔定型熱效力檢驗方法（該效檢方法是通過兔子體溫變化間接定量豬瘟疫苗病毒含量的方法，由于我國并沒有檢驗用兔標準，導致各批次疫苗的批間抗原量差異大，免疫效果也極不穩定）。FAID50應用免疫熒光方法對病毒半數組織感染量進行測定，即把豬瘟疫苗按不同的稀釋度接種到傳代細胞上增殖，通過熒光色素標記抗體與細胞表面及細胞漿內的豬瘟抗原結合后，置熒光顯微鏡下觀察，細胞漿中出現特異性熒光即判斷有一定量的病毒復制，實現了在細胞水平對豬瘟病毒進行更準確的定量，為保持產品穩定、減少產品批間差提供了保障。

1.3 亞單位疫苗

亞單位疫苗是將病原體保護性抗原基因導入到受體細胞或細菌中，使抗原蛋白獲得高效表達，并將表達的蛋白與佐劑聯合制成的疫苗。亞單位疫苗與常規滅活疫苗相比，安全性更好，但免疫原性略差，需要和佐劑同時使用才能達到免疫效果。由于豬瘟病毒E2蛋白是豬瘟病毒的主要保護性抗原，能誘導機體產生中和抗體，使E2蛋白成為是豬瘟亞單位疫苗研究的首選蛋白。目前我國市場上商品化的該類疫苗只有豬瘟病毒E2蛋白重組桿狀病毒滅活疫苗（Rb-03株），該疫苗是將豬瘟病毒E2蛋白重組于桿狀病毒內，在昆蟲細胞上培養表達豬瘟病毒E2蛋白而制成的新型基因工程疫苗。由于該疫苗不是全病毒疫苗，而是一種僅含有豬瘟E2抗原蛋白的標記疫苗，不存在全病毒弱毒疫苗基因突變或毒力返強的危險，具有良好的安全性，同時該疫苗只誘導豬體產生E2蛋白抗體，因此可以通過對E2蛋白和非E2蛋白的抗體檢測來區分豬只是感染了野毒還是免疫了疫苗，彌補了豬瘟兔化弱毒疫苗不能區分野毒感染與疫苗免疫動物的缺陷，為我國豬瘟的凈化提供了技術支持，將有力推動我國豬瘟防控從預防控制向免疫凈化階段的邁進。

2 新型疫苗研究

2.1 核酸疫苗

核酸疫苗又稱DNA疫苗或基因疫苗，是將含有病原體結構蛋白的真核表達載體作為疫苗直接進行免疫，使機體產生特異性免疫應答的一類基因疫苗，其能夠同時誘導細胞免疫和體液免疫，可產生持久性的免疫應答反應，具有易于生產、方便保存運輸、可誘導機體長期或終身免疫、可制備針對多種病原體的多價疫苗等優點。郭抗抗等[4]將豬瘟病毒E2基因定向克隆至表達載體pSCA1中，構建DNA疫苗重組質粒pSCA1-E2，將純化的pSCA1-E2質粒分別免疫小鼠和試驗豬，二免后分別檢測小鼠脾淋巴細胞刺激指數和豬血清抗豬瘟特異性抗體水平，免疫小鼠產生較高水平的淋巴細胞刺激指數，免疫豬可檢測到抗豬瘟特異性血清抗體，為進一步研制新型豬瘟核酸疫苗提供了基礎材料。

2.2 活載體重組疫苗

重組活載體疫苗是將病原體的保護性抗原基因與其他具有復制功能的其他載體病毒進行重組，該類重組疫苗可通過多種途徑進行免疫，可以誘導動物機體產生體液免疫和細胞免疫，目前豬瘟E2蛋白基因已經在痘病毒、腺病毒、偽狂犬病病毒等不同的病毒載體中獲得表達，在臨床試驗中顯示出巨大的潛在應用價值。

2.2.1 痘病毒活載體疫苗 痘病毒以其宿主特異性、外源基因容量大、在哺乳動物中發生頓挫感染等特性成為構建動物病毒活載體疫苗的首選載體之一，李譜華等[5]將豬瘟病毒E2蛋白基因片段定向克隆到重組雞痘病毒表達載體FPV-P11上，將該質粒轉染至雞痘病毒感染的雞胚成纖維細胞后篩選出重組雞痘病毒FV282-CSFV-E2，將該重組雞痘病毒3次腹腔接種小鼠，ELISA檢測血清中豬瘟病毒抗體滴度為1∶4 096，將該重組雞痘病毒頸部和腹股溝皮下分點注射免疫豬3次，4周后用豬瘟病毒石門強毒株以100 LD50接毒量攻擊，保護率達75%，為豬瘟重組雞痘病毒活載體疫苗的研制奠定了基礎。

2.2.2 腺病毒活載體疫苗 腺病毒具有基因轉移效率高、毒力低、宿主范圍廣、外源基因裝載容量大等優點，能夠在體內表達天然的、保持完整生物活性的抗原蛋白并誘導特異性體液免疫應答和細胞免疫應答，是一種良好的活病毒載體。楊玉艾等[6]將豬瘟病毒E0和E2基因定向亞克隆于穿梭載體pAdTrack-CMV中構建攜帶E0-E2基因的重組腺病毒轉移載體質粒pAdEasy-E0-E2，將其轉染人胚胎腎細胞成功包裝出重組腺病毒rAd-E0-E2，將rAd-E0-E2經肌肉2次免疫接種6～7周齡豬，3周后用103TCID50的豬瘟野毒株（石門株）攻擊，rAd-E0-E2免疫組豬存活率達85.71%，而非重組E0-E2基因的腺病毒免疫組和空白對照組全部死亡，表明rAd-E0-E2能使免疫豬抵抗豬瘟強毒攻擊，為豬瘟腺病毒重組活載體疫苗的研究開發奠定了基礎。

2.2.3 偽狂犬病病毒活載體疫苗 偽狂犬病（Pseudorabies,PR）是由偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）引起豬的以仔豬的高死亡率、母豬的繁殖障礙、公豬種用性能降低或喪失、肥豬的神經及呼吸系統癥狀為主要特征的急性傳染病，PRV基因組編碼70～100種蛋白，其中含有大量與病毒增殖無關的非必需區可供外源基因的插入，是優良的活病毒載體。韓爽等[7]以 TK、gI、gE、US9、部分gN基因缺失的PRV-BE為親本株，通過同源重組構建了表達豬瘟病毒主要免疫原性基因E2的重組偽狂犬病病毒PRV-CSFV PE2SC，對重組病毒在PK15細胞中的遺傳穩定性、增殖特性等進行的研究表明重組病毒在體外連續傳20代后仍能穩定遺傳，具有良好的遺傳穩定性及體外復制能力，該活載體疫苗可同時預防豬瘟和偽狂犬病兩種主要傳染病，為豬瘟和豬偽狂犬病根除計劃的實施提供了技術保障。

2.3 合成肽疫苗

合成肽疫苗是指根據病原體基因組核苷酸序列推導出其蛋白質的氨基酸序列，通過人工合成的方式制備相應的氨基酸寡肽，偶聯佐劑制成疫苗。Zhou等[8]合成了豬瘟E2蛋白的兩個B細胞線性表位RE2-A和RE2-B，獲得了豬瘟多表位疫苗，將該疫苗兩次免疫動物后可產生中和抗體。Tian等[9]構建了串聯多個豬瘟E2抗原表位的多肽疫苗，攻毒試驗顯示多肽疫苗可保護免疫豬抵抗豬瘟病毒野毒株的攻擊。合成肽疫苗能根據病毒變異情況快速開發出有效的針對性疫苗，具有極高的開發前景，但合成肽疫苗由人工合成制得，單一的線性抗原表位對病毒的保護力有限，多個中和表位串聯和添加合適的佐劑是目前增強合成肽疫苗免疫原性的有效手段，而對豬瘟病毒抗原表位和空間構像的深入研究是開發合成肽疫苗的關鍵。

2.4 全長感染性cDNA標記疫苗

全長感染性cDNA標記疫苗是利用反向遺傳學技術將具有標記性的基因替換或克隆到致弱病毒全長cDNA中獲得重組病毒，是利用標記基因區分疫苗株和野毒株的一類疫苗。隨著反向遺傳學技術的快速發展和在動物病毒學領域的應用，豬瘟全長感染性cDNA標記疫苗得到了研究學者的廣泛關注，其將標記性基因克隆到豬瘟病毒弱毒cDNA中，從而使疫苗具有區分野毒感染和疫苗免疫的優勢，是亟需大力發展的一種新型豬瘟疫苗。鄒興啟等[10]以豬瘟病毒C株為研究材料，經RT-PCR擴增獲得涵蓋全長的6個片段，用合適的酶切位點連接，成功構建了C株全長感染性克隆pAC-CS，體外轉錄得到RNA，然后將其分別轉染BHK-21和SK6細胞，通過RT-PCR、免疫過氧化酶單層細胞試驗和兔體發熱試驗檢測表明成功構建了豬瘟病毒C株感染性克隆，為新型豬瘟cDNA標記疫苗的研發提供了試驗依據。

3 小結與展望

自2007年起，我國采取了以強制免疫為主的豬瘟綜合防控策略，在實施了近10年的強制免疫政策后，2017年國家取消了豬瘟強制免疫政策，改為對符合條件的養殖場實行“先打后補”的財政補助政策，表明我國豬瘟防控工作取得了階段性成果，豬瘟防控進入了新的歷史階段，距離實現豬瘟防控的終極目標（凈化）已經不遠。無需置疑的是，傳統疫苗在我國防控豬瘟中發揮了不可替代的巨大作用，但其無法區分野毒感染和疫苗免疫動物的缺陷已經不能完全滿足以后國家豬瘟凈化工作的需要。與傳統疫苗相比，新型疫苗能夠區分野毒感染和疫苗免疫，且具有廉價、安全、高效、易于運輸與保存等優點，其在豬瘟防控中將發揮越來越重要的作用，實現理想的免疫效果，但當前我國在新型疫苗中只有亞單位疫苗實現了商品化，其它的新型疫苗尚處于研究階段，相信隨著基因工程技術的不斷發展以及豬瘟免疫機制研究的不斷深入，豬瘟的各類新型疫苗將會逐步得到完善，為我國豬瘟的綜合防控和凈化提供技術保障。