豬流行性腹瀉與鏈球菌混合感染診斷分析

趙海忠，李良華，宋忠旭，孫 華，彭先文，梅書棋

（湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/動(dòng)物胚胎工程及分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430064）

豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea,PED）是由豬流行性腹瀉病毒（Porcineepidemicdiarrheavirus,PEDV）引起的豬的一種急性、高度接觸性腸道傳染病，臨床上以急性腸炎和伴有水樣腹瀉、嘔吐、脫水迅速、食欲減退為特征。PED于1971年在英格蘭首次被發(fā)現(xiàn)，20世紀(jì)80年代初我國(guó)陸續(xù)發(fā)生本病。2010年10月以后，新的高毒力PEDV毒株引起的PED在全國(guó)范圍內(nèi)暴發(fā)流行，以各個(gè)年齡段的豬均可發(fā)病和哺乳仔豬高死亡率為特征，給養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。

豬鏈球菌病（Swine streptococcosis）是由多種致病性豬鏈球菌（Streptococcus suis）引起的一種重要的人畜共患病。豬鏈球菌病一年四季均可發(fā)生，無(wú)明顯的發(fā)病季節(jié)，但在天氣悶熱的夏秋季節(jié)為高發(fā)期，3～12周齡的仔豬最易感，多呈地方性流行，其在臨床上可分為敗血癥型、腦膜炎型、關(guān)節(jié)炎型、淋巴結(jié)膿腫型等。豬鏈球菌病是嚴(yán)重危害當(dāng)前養(yǎng)豬生產(chǎn)的重要細(xì)菌類疾病，給養(yǎng)豬業(yè)造成較大經(jīng)濟(jì)損失[3]。

2019年12月末，湖北某規(guī)模化豬場(chǎng)產(chǎn)房仔豬出現(xiàn)吐奶、水樣腹瀉、脫水等癥狀，發(fā)病率達(dá)90%，死亡120余頭。筆者經(jīng)過(guò)嚴(yán)謹(jǐn)了解發(fā)病情況，結(jié)合流行病學(xué)調(diào)查、臨床剖檢初步診斷為PED，采樣送畜牧獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原學(xué)診斷，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果表明PEDV和S.S混合感染可能是引起本次仔豬腹瀉的主要原因。采取綜合防控措施后，腹瀉疫情得到有效控制。本例PEDV混合感染S.S具有實(shí)踐特異性，其診斷、治療的有效性對(duì)養(yǎng)豬同行具有良好的參考借鑒。

1 發(fā)病情況

2019年12月末，氣溫驟降，該豬場(chǎng)產(chǎn)仔單元1頭初胎母豬所產(chǎn)仔豬食欲下降，精神萎靡，先出現(xiàn)嘔吐，繼而水樣腹瀉，肛門失禁，邊走邊拉，糞便中含有小的未消化的凝乳塊，呈黃色或白色，糞便惡臭。同產(chǎn)仔單元其它仔豬腹瀉快速蔓延，發(fā)病率達(dá)90%，部分仔豬腹瀉脫水、皮膚充血、潮紅，共濟(jì)失調(diào)，黏膜發(fā)紺，四肢內(nèi)側(cè)、腹下皮膚發(fā)紫，跛行，不愿站立，觸壓有熱痛，驅(qū)趕時(shí)尖叫，少量病豬出現(xiàn)角弓反張等神經(jīng)癥狀。初胎母豬所產(chǎn)仔豬腹瀉更嚴(yán)重，部分仔豬脫水死亡，7日齡內(nèi)仔豬病死率可高達(dá)100%（圖1）。

2 臨床剖檢

對(duì)臨床上6頭嚴(yán)重腹瀉瀕臨死亡仔豬進(jìn)行解剖，其主要病變?yōu)椋何傅撞繚儭⒊錆M大量的未消化的奶酪樣物質(zhì)，腸管呈半透明狀，腸壁擴(kuò)張變薄，內(nèi)有黃色黏稠液體（圖2），腸系膜呈樹(shù)枝狀充血、出血、淋巴結(jié)呈索狀腫大，脾稍腫大。部分病例可見(jiàn)心包積液增多、呈淡淡的青色，肺臟邊緣有黃色纖維素性滲出物，肺間質(zhì)增寬，腎臟腫大。分別無(wú)菌采集發(fā)病豬腸道、淋巴結(jié)、肝臟、脾臟、肺臟、糞便等病料冷藏保存后立即送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)。

3 實(shí)驗(yàn)室診斷

3.1 病毒RT-PCR檢測(cè)

樣品送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行腹瀉相關(guān)病原學(xué)檢測(cè)。采用RT-PCR方法檢測(cè)PEDV、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬輪狀病毒（PoRV）。采用多重 RT-PCR方法擴(kuò)增PEDV M基因、TGEV N基因和PoRV的VP7基因，樣品中有PEDV存在時(shí)，可擴(kuò)增出668 bp的片段；樣品中有TGEV存在時(shí)，可擴(kuò)增出528 bp的片段；樣品中有PoRV存在時(shí)，可擴(kuò)增出333 bp的片段[4]。RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果見(jiàn)圖3，檢測(cè)結(jié)果顯示，6份樣品中5份擴(kuò)增出PEDV的M基因668 bp的片段，未擴(kuò)增出TGEV的N基因528 bp的片段和PoRV的VP7基因333 bp的片段，表明檢出PEDV陽(yáng)性比例為83.3%，TGEV、PoRV均為陰性。

3.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)

將樣品接種血清瓊脂平板進(jìn)行病原菌分離培養(yǎng)，37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)，菌落呈圓形、表面光滑、中央隆起、邊緣整齊、透明、灰白色、針尖大的露珠狀小菌落，并產(chǎn)生明顯的β型溶血。用接種環(huán)挑取典型菌落進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢，革蘭氏染色陽(yáng)性，菌體呈球形或橢圓形，并呈短鏈狀或成對(duì)或單個(gè)排列，見(jiàn)圖4。

3.3 動(dòng)物致病性試驗(yàn)

挑取上述單個(gè)菌落接種于THB培養(yǎng)基中做增菌培養(yǎng)，37℃溫箱培養(yǎng)24 h，將培養(yǎng)菌液混合后腹腔注射10只SPF級(jí)小鼠，0.2 mL/只，另設(shè)10只小白鼠生理鹽水對(duì)照，相同條件下飼養(yǎng)，連續(xù)觀察7 d，攻菌12 h后試驗(yàn)組部分小鼠出現(xiàn)食欲下降、精神萎靡、行動(dòng)遲緩等臨床癥狀，試驗(yàn)結(jié)束共有7只小鼠死亡，對(duì)照組10只小鼠均健活。試驗(yàn)結(jié)果表明，該鏈球菌分離菌株具有較強(qiáng)的致病性。

3.4 藥敏試驗(yàn)

采用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。挑取頭孢噻呋、阿莫西林、氨芐西林等20種抗生素藥敏片，用滅菌鑷子把藥敏片均勻貼在涂有菌液的平板上，于37℃靜置培養(yǎng)24 h，取出觀察并記錄藥敏片抑菌圈直徑[5]。藥敏性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明，分離的菌株對(duì)氨芐西林、阿莫西林、頭孢呋辛、頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢噻呋高度敏感。對(duì)鏈霉素、磺胺嘧啶、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、四環(huán)素、多西環(huán)素、多黏菌素B、復(fù)方新諾明、林可霉素、慶大霉素、大觀霉素耐藥。

表1 鏈球菌藥敏性試驗(yàn)結(jié)果

4 診斷結(jié)果

綜合場(chǎng)內(nèi)發(fā)病情況、臨床剖檢、病原學(xué)檢測(cè)，此次仔豬腹瀉疫情主要為PEDV與S.S混合感染所致。

5 綜合防控

5.1 緊急免疫

全群種豬接種豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉二聯(lián)活疫苗（科腹凈）1頭份+豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉二聯(lián)滅活疫苗（科瀉寧）2 mL，一邊一針，間隔2周后，加強(qiáng)免疫科瀉寧2 mL；2～3日齡哺乳仔豬同步免疫科瀉寧1 mL。同時(shí)使用豬鏈球菌三價(jià)滅活疫苗2 mL對(duì)豬群進(jìn)行免疫。

5.2 生物安全措施

對(duì)發(fā)病豬舍進(jìn)行隔離，產(chǎn)房腹瀉母豬提前斷奶，禁止將腹瀉后未完全康復(fù)的母豬帶入產(chǎn)房；及時(shí)處死無(wú)治療價(jià)值的病豬，對(duì)于15日齡以上發(fā)病仔豬立即采取母子分離寄養(yǎng)于健康哺乳母豬，用干粉消毒劑掩蓋仔豬的嘔吐物和拉稀的糞便，并及時(shí)清理，降低環(huán)境載毒量，切斷水平感染[6]。加強(qiáng)消毒，場(chǎng)區(qū)大環(huán)境每日消毒1次，舍內(nèi)使用“仔力健”干粉消毒劑噴粉消毒，過(guò)道鋪撒石灰，保持舍內(nèi)干燥。發(fā)病單元清空后，及時(shí)清洗消毒，干燥后再用甲醛熏蒸，空欄10 d以上。

5.3 對(duì)癥治療

對(duì)腹瀉仔豬主要應(yīng)用抗生素和口服補(bǔ)液鹽來(lái)進(jìn)行對(duì)癥治療，使用1%左右口服補(bǔ)液鹽（添加適量蒙脫石散）3～10 mL，較嚴(yán)重病例同時(shí)肌注2～5 mL注射液（黃芪多糖+頭孢），連用3 d；同窩未發(fā)病仔豬預(yù)防用藥1次，劑量減半；嚴(yán)重脫水仔豬及時(shí)進(jìn)行補(bǔ)液（維生素C 1 mL+復(fù)合維生素B 1 mL+恩諾沙星1～3 mL+5%葡萄糖鹽水20～60 mL）。同時(shí)在飼料中添加藥物，每噸分別添加10%阿莫西林600 g+復(fù)方黃芪多糖500 g+電解質(zhì)多維1 000 g；恢復(fù)階段仔豬料中添加益生菌、奶粉等，修復(fù)胃腸道功能，提高胃腸道健康，增加采食量，促進(jìn)仔豬生長(zhǎng)。

5.4 精細(xì)化飼養(yǎng)管理

首先改善飼養(yǎng)環(huán)境，保持舍內(nèi)環(huán)境溫濕度在豬只適宜范圍內(nèi)，注意通風(fēng)換氣，保持產(chǎn)房相對(duì)干燥，營(yíng)造舒適豬舍小環(huán)境。其次合理有效護(hù)理，產(chǎn)前2 h預(yù)熱保溫箱，使箱內(nèi)溫度33℃左右，后期溫度適當(dāng)降低。提供優(yōu)質(zhì)全價(jià)飼料，保持臨產(chǎn)母豬良好體況，保證母豬產(chǎn)后乳汁充足；用溫?zé)崦頍岱竽肛i乳頭，輔助仔豬固定奶頭，及時(shí)吃夠初乳。最后，做好豬群管理，實(shí)行全進(jìn)全出和批次化生產(chǎn)，降低飼養(yǎng)密度。

6 討論

6.1 科學(xué)合理免疫是防控PED最有效措施之一。免疫后產(chǎn)生高水平保護(hù)性IgA抗體是PED免疫成功的關(guān)鍵[7]，需定期開(kāi)展免疫抗體監(jiān)測(cè)，掌握豬群健康動(dòng)態(tài)。該場(chǎng)免疫程序不科學(xué)，豬群未產(chǎn)生足夠的保護(hù)性免疫抗體，同時(shí)氣溫驟降冷應(yīng)激，誘發(fā)豬群發(fā)生PEDV和S.S混合感染。科學(xué)合理的免疫程序尤為重要，選擇與本場(chǎng)匹配度高的PED疫苗，采取普免+跟胎免疫相組合免疫方案，每年9月份普免科腹凈1頭份+科瀉寧2 mL，間隔4周后加強(qiáng)免疫科瀉寧2 mL；母豬產(chǎn)前40 d免疫科腹凈1頭份+科瀉寧2 mL，一邊一針，產(chǎn)前20 d加強(qiáng)免疫科瀉寧2 mL。活苗與滅活苗聯(lián)合使用臨床保護(hù)效果較好[8]，母豬在臨產(chǎn)時(shí)初乳中含抗PEDV抗體最高，剛出生的仔豬吃了初乳后可獲得高滴度母源抗體，從而有效防止PED發(fā)生。

6.2 定期進(jìn)行病原監(jiān)測(cè)和抗體檢測(cè)，建立預(yù)警機(jī)制。引起仔豬腹瀉的因素很多，一旦發(fā)現(xiàn)產(chǎn)房仔豬腹瀉，盡快采樣送檢，快速進(jìn)行病原學(xué)鑒別診斷，確定發(fā)病原因，采取針對(duì)性防控措施。最新流行病學(xué)調(diào)查研究結(jié)果顯示，PEDV、S.S等病原體常常發(fā)生混合感染，導(dǎo)致豬群病死率上升[9]。該豬場(chǎng)送檢的病料中檢測(cè)出PEDV和S.S，S.S感染可能破壞了仔豬的免疫系統(tǒng)、加重了PED疫情并且降低了PED疫苗免疫效果，這可能是哺乳仔豬長(zhǎng)時(shí)間腹瀉并造成大量死亡的主要原因[10]。因此，在混合感染高發(fā)的態(tài)勢(shì)下，采取科學(xué)有效的綜合防控措施更為重要，特別要做好初胎母豬管理。對(duì)豬群定期采集樣品進(jìn)行監(jiān)測(cè)，優(yōu)化免疫程序，加強(qiáng)生物安全管理，做好飼養(yǎng)管理和衛(wèi)生消毒工作，定期進(jìn)行豬群保健，將疾病發(fā)生的幾率降低到最低限度，減少不必要的經(jīng)濟(jì)損失。

6.3 豬鏈球菌的耐藥特性呈上升趨勢(shì)，對(duì)很多常規(guī)藥物具有耐藥性。本研究發(fā)現(xiàn)，鏈球菌分離菌株對(duì)11種臨床常用藥物全部耐藥，其耐藥程度相當(dāng)嚴(yán)重，豬鏈球菌耐藥已成為全球性問(wèn)題。李文嫻等報(bào)道2017年河南省8株豬鏈球菌對(duì)恩諾沙星、環(huán)丙沙星高度敏感[11]，但本次試驗(yàn)鏈球菌分離菌株對(duì)環(huán)丙沙星、恩諾沙星均產(chǎn)生了耐藥，需要引起養(yǎng)殖場(chǎng)重視。臨床防治豬鏈球菌病時(shí)，應(yīng)根據(jù)本場(chǎng)藥敏試驗(yàn)結(jié)果選擇高敏藥物，科學(xué)、規(guī)范、合理用藥。