5型副豬嗜血桿菌河南分離株的毒力基因研究

張青嫻，徐引弟，王治方，朱文豪，焦文強，李海利

（1.河南省農業科學院畜牧獸醫研究所，河南 鄭州 450002；2.河南省畜禽繁育與營養調控重點實驗室，河南 鄭州 450002）

副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis,HPS）是豬多發性漿膜炎和關節炎（格拉瑟病）的病原體，常定植在豬的上呼吸道，在環境應激和感染免疫抑制性疾病時副豬嗜血桿菌進入血液暴發本病，引發全身性細菌感染[1]。

副豬嗜血桿菌至少分為15種血清型，我國流行的血清型為1、4、5和13，河南省以4型和5型居多[2-6]。目前常用的疫苗為全細菌滅活苗，但只對血清型1、4、5和6有保護力。血清型之間的交叉保護不一致，也缺乏區分感染豬和疫苗豬的可用方法，當疫苗株與臨床分離株血清型不一致時，疫苗無法提供足夠的免疫保護[7-9]。到目前為止尚未發現毒力和血清型之間的絕對關系，不同血清型的副豬嗜血桿菌分離株可攜帶不同的毒力基因[10-12]。檢測田間分離株的毒力基因，探究其與血清型的相關性，有助于預測副豬嗜血桿菌分離株的致病力，而確定菌株的致病潛力對診斷和疾病控制很重要。

本試驗對豫北某豬場疑似副豬嗜血桿菌病進行分離鑒定、血清型分型、毒力基因擴增和致病性試驗，旨在探究副豬嗜血桿菌毒力因子的功能及其與血清型的相關性，為進一步認識其致病機理及研發新型亞單位疫苗和診斷試劑提供重要依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 病料來源于豫北某豬場的疑似病豬，包括肺臟、心血、肝臟、脾臟、腎臟、腦脊液、關節液等，于2019年10月至2020年1月在河南省農業科學院畜牧獸醫研究所傳染病研究室進行分離鑒定及后續工作。

1.1.2 主要試劑 胰蛋白胨大豆瓊脂培養基（tryptic soy agar,TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯培養基（tryptic soybroth,TSB）為美國BD公司產品；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide,NAD）為Sigma公司產品；革蘭氏染色液為珠海貝索生物技術有限公司產品；新生牛血清為鄭州益康生物工程有限公司產品；PCR分子生物學試劑為寶生物（大連）工程有限公司產品。DMSO、甘油和甲氧氟醚等普通化學試劑購自北京陸橋技術股份有限公司。

1.1.3 試驗動物 體重250～300 g的雄性豚鼠，購于鄭州大學第一附屬醫院實驗動物中心。

1.1.4 引物 參考Angen等[13]的方法，根據HPS M75065株16S rRNA的保守區基因設計特異性鑒定引物HPS F1/F2/R，擴增片段長度為1 090 bp。

F1：5'-TATCGRGAGATGAAAGAC-3'，F2：5'-GT AATGTCTAAGGACTAG-3'，R：5'-CCTCGCGGCTTCG TC-3'。

參考Howell等[14]的方法，合成用于鑒定HPS血清型的引物（表1）；參考樂敏等[15-17]的方法，合成鑒定HPS毒力因子的引物（表2）。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 血清型分型引物序列

表2 毒力基因引物序列

1.2 方法

1.2.1 細菌的分離培養 無菌采集病死豬的肺臟、心血、肝臟、脾臟、腎臟、腦脊液、關節液等病料，于生物安全柜內接種于TSA平皿（含5%新生牛血清和10 μg/mL NAD）上，37 ℃恒溫培養 36～48 h。接種環挑取純培養的細菌重懸于30 μL超純水中，加入蛋白酶K 56℃裂解1 h。將混合物煮沸30 min，冰上冷卻，于12 000 r/min離心3 min后收集上清液。使用動物全基因組DNA提取試劑盒提取1657株DNA。

16S rRNA PCR 反應體系（總體積 25 μL）包括12.5 μL 2×Taq PCR master mix，上游引物（50 μmol/L）下游引物（50 μmol/L）1 μL，8.5 μL 超純水和 2 μL DNA模板（濃度>10 ng/μL）。反應條件如下：94℃初始變性3 min；35個循環，94 ℃ 1 min，56 ℃ 45 s，72 ℃1 min，最終72℃延伸5 min。使用1%瓊脂糖凝膠電泳分析擴增產物。

將16S rRNA擴增陽性產物測序，鑒定所有可疑的副豬嗜血桿菌菌落。無菌條件下接種環挑取PCR鑒定陽性的菌落置于2 mL TSB肉湯（含5%新生牛血清和 10 μg/mL NAD）中，37 ℃培養 18～24 h，添加30%甘油分裝保存在-80℃備用。

1.2.2 血清分型 配置反應體系如下：25 μL體系，12.5 μL 2×Taq PCR master mix，1.5 μL 上游引物（50 μmol/L），1.5 μL 下游引物（50 μmol/L），2 μL DNA模板（濃度>10 ng/μL），0.25 μL 的 DMSO 和 7.25 μL的超純水進行PCR：94℃初始變性2 min；35個循環，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，最終 72 ℃延伸5 min。使用2%瓊脂糖凝膠電泳分析擴增產物。

1.2.3 毒力基因鑒定 已知的毒力基因、引物和每種擴增產物的大小如表2所示。PCR反應體系（總體積 25 μL）包括 12.5 μL 2×Taq PCR master mix，2 μL每條引物（50 μmol/L），7.5 μL 超純水和 1 μL DNA（濃度>10 ng/μL）。94℃初始變性2 min；35個循環，94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，最終72℃延伸5 min。使用2%瓊脂糖凝膠電泳分析擴增產物。

1.2.4 致病力試驗 經預試驗，副豬嗜血桿菌1657株腹腔感染的半數致死量為1.8×109CFU。故將腹腔感染試驗分組和菌量安排如下：分為3個試驗組和1個空白對照組，每組5只豚鼠，試驗組每只豚鼠接種的劑量為 1 mL，菌量分別為 4.0×109CFU、2.0×109CFU和4.0×108CFU。空白對照組接種1 mL生理鹽水。試驗結束時，存活的小鼠用過量的甲氧氟醚殺死。

2 結果

2.1 HPS 1657株的分離鑒定

肺組織經48 h培養后，在TSA平皿上長出直徑約0.2 mm、光滑圓潤、無色透明的針尖狀小菌落，革蘭氏染色為多個不同形狀的菌體，呈短桿狀、桿狀或長絲狀。將該菌株命名為1657株。其他組織未分離出可疑致病菌。

經16S rRNA PCR鑒定后，1%瓊脂糖凝膠電泳可見大小為1 090 bp的目的片段（圖1）。測序結果經NCBI網站BLAST序列對比后與HPS吻合率99.8%以上，故1657株為HPS。

2.2 HPS 1657株的血清型鑒定

用PCR方法擴增15種血清型，經2%瓊脂糖凝膠電泳后，在450 bp處出現一條明亮的目的條帶（圖2），將擴增產物測序，經NCBI網站BLAST序列對比后與5型HPS吻合率99.8%以上，故1657株為5型HPS。

2.3 HPS 1657株的毒力基因測定

以分離株的DNA為模板，用PCR方法擴增上述14種毒力基因，2%瓊脂糖凝膠電泳分析，得到全部為陽性的目的條帶（圖3）。

2.4 HPS 1657株的致病性試驗

腹腔注射試驗結果顯示，豚鼠感染后4 h內即出現食欲廢絕、呼吸困難、精神沉郁和共濟失調等癥狀，6 h后出現死亡。最終7 d內高劑量組豚鼠死亡4只，中間劑量組有2只死亡，而最低劑量組和空白對照組無死亡豚鼠。剖檢死亡豚鼠后可見典型的敗血癥、纖維素性多發性漿膜炎、胸腹腔積液、關節炎和腦膜炎等癥狀，中間劑量組未出現漿膜炎癥狀，未死亡豚鼠無明顯癥狀。無菌取死亡豚鼠的肺臟、腎臟、脾臟、肝臟、心血、關節液和腦脊液等主要器官，接種含NAD和新生小牛血清的TSA培養基，能再次分離到該種病原菌，未死亡的豚鼠未分離出該菌。上述試驗表明1657株在菌液濃度為2.0×109CFU/mL即可達到半數致死量，說明1657株毒力較強。

3 小結

本次分離的副豬嗜血桿菌1657株為肺分離株，血清型為 5型，14種毒力基因（lsgB、capD、vta1、vta2、vta3、wza、hhdA、hhdB、ompP2、nanH、cdtA、cdtB、cdtC、espP2）均為陽性，且致病性試驗顯示為強毒株。

4 討論

菌株的血清型通常被視為菌株毒力強弱的標志，血清型與毒力之間存在一定的相關性，也有研究發現這種關系并不確定[18]。部分血清型相同但不同分離地區的菌株在毒力試驗時表現出差異性，約有15%～41%毒力較強的菌株無法確定血清型，使HPS流行病學研究遇到一定阻力[19]。

目前對副豬嗜血桿菌致病性的研究主要集中于毒力因子，但毒力因子的數量與功能尚未完全探究清楚。唾液酸轉移酶編碼基因lsgB基因主要存在于組織部位分離的副豬嗜血桿菌中，而從鼻腔分離的菌株中均未檢測到，且lsgB只存在于毒性菌株中[20]。副豬嗜血桿菌具有神經氨酸酶基因nanH和神經氨酸酶活性。神經氨酸酶基因nanH能夠清除宿主的唾液酸，唾液酸可作為碳源和/或氮源通過唾液酸轉移酶lsgB被整合入脂寡糖[21]。假定莢膜產生基因capd基因編碼一種多糖生物合成蛋白，該蛋白與副豬嗜血桿菌的毒性有關[22]。wza基因在毒力因子莢膜多糖轉運過程起重要作用，缺失wza基因能使HPS毒力顯著降低[23]。vta3在毒力菌株和無毒力菌株中均高度保守，而vta1和vta2主要在致病菌株中為陽性[24]。體內感染條件下，細胞致死膨脹毒素操縱子（cytolethal distending toxin,cdt）和溶血毒素操縱子hhd均出現上調表達，表明該類毒素基因是副豬嗜血桿菌直接發揮細胞毒性作用的重要武器[15]。Mcvicker等發現副豬嗜血桿菌與流感嗜血桿菌具有同源性的外膜蛋白ompP2和ompP5，該蛋白與細菌黏附有關，在毒力株和非毒力株中蛋白的分子質量大小有所不同[25]。血清 2、4、5、10、12、13、14、15 型HPS株的ompP2基因在450～524 bp和770～844 bp范圍內，存在共計100 bp左右的堿基缺失，而血清1、3、6、7、8、9、11 型參考菌株 ompP2 基因不存在缺失，并且這些發生堿基連續缺失的參考血清型菌株均為公認的毒力菌株[26]。胞外絲氨酸蛋白酶（extracellular serine protease,ESP）在感染豬的過程中發生表達，esp P2蛋白與流感嗜血桿菌編碼IgA蛋白酶的基因具有同源性，豚鼠用重組esp P2蛋白免疫后，對HPS的攻毒產生了部分保護[27]。Chao等通過研究越南中部副豬嗜血桿菌分離株的血清型和毒力基因的表 征 發 現 ，lsgB、capD、wza、hpm-1372、hpm-1373、vta2和vta3等大多數毒力基因分布在高度和中度毒力血清型組，5/12型血清型與capD有一定相關性[28]。樂敏首次繪制出副豬嗜血桿菌SH0165株基因組的潛在毒力因子圖，篩選出部分主要的毒力相關基因或操縱子基因（nanH、oapA、ompP5、pilA、ompP2、cdtABC、hhdAB、prtC、sodAC、sphB、espP、fkpA、mip、mviN和HAPS-0694），發現所篩選出的基因在我國HPS流行菌株中高度保守，推測這些毒力基因很有可能是HPS致病關鍵因子[15]。HPS毒力因子的界定將大大提高毒力和非毒力菌株的鑒別，需要更多的研究來驗證副豬嗜血桿菌各毒力蛋白的具體作用[29]。

綜上所述，本研究分離的副豬嗜血桿菌1657株為血清型5型菌株，且含有多種毒力基因，其強致病性可能由于多個毒力基因的協同作用，是否上述毒力因子是決定HPS致病力的基因還有待于進一步的基因敲除與回歸試驗驗證[30]；是否被界定為強毒株的血清型中均含有上述毒力基因有待進一步擴大田間分離株范圍。

Morozumi等選擇小鼠作為HPS試驗模型，基本不發病或者死亡很少，且病變很少[31]。但由于小鼠操作上的優越性，可作為篩選HPS毒力蛋白的模型[23，32]。本試驗采用豚鼠做為試驗動物模型，很大程度上還原了副豬嗜血桿菌病的流行病經過，相比SPF豬代價低，周期短，可以作為HPS試驗動物首選。

本文提供了豫北某發病豬場副豬嗜血桿菌血清型和毒力基因的第一手資料，研究了該分離株血清型與毒力基因的相關性，對了解該地區的副豬嗜血桿菌流行病學特征和防控該病具有重要意義。