魯西北地區仔豬大腸桿菌病流行病學調查和耐藥性分析

龐麗麗，王懷中，呼紅梅，朱榮生，王建才，劉興華，黃保華

（1.山東省農業科學院畜牧獸醫研究所，山東 濟南 250100；2.青島農業大學動物醫學院，青島 266000）

大腸埃希氏菌（Escherichia coli）是兼性厭氧菌，屬于腸桿菌科，革蘭氏染色呈陰性、無芽孢、可以分解葡萄糖，是人和動物后腸段的正常菌群之一。目前已經清楚的血清型數量有近千種，絕大部分血清型無病原性或為條件致病菌，少部分已知血清型為條件性致病菌，其中產腸毒素大腸桿菌（Enterotoxi genic E.coli,ETEC）是造成初生仔豬發病的主要病原菌[1]，其分泌的黏著素性菌毛和腸毒素可導致仔豬黃白痢和水腫病，主要表現為腹瀉、脫水、急性死亡等。時至今日，大腸桿菌病仍然是養豬業的一個多發疾病[2-4]。現今國內養豬業仍以抗生素療法為最常用的預防及治療方法，但抗生素等藥物的不合理使用造成了耐藥性大腸桿菌的快速產生和擴散，直接導致了細菌性疾病治愈的困難。

為了解魯西北地區規模化豬場的仔豬大腸桿菌病流行情況，2018年10月從某市12家規模化豬場中了解到有7家豬場頻發仔豬腹瀉，于是從此7家豬場中采集發病仔豬病料分離大腸桿菌，并對分離的菌株進行血清型鑒定及耐藥性檢測，從實驗室診斷方面為地方大腸桿菌的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料來源

2018年10月從魯西北地區的7家臨診發生仔豬腹瀉的規模豬場中，采集60日齡內發病腹瀉仔豬的肛試糞樣，共24份病料。

1.2 主要試劑

伊紅美藍培養基（EMB）、麥康凱培養基（MAC）、SS培養基、營養瓊脂培養基、肉湯培養基（MHB）、肉湯瓊脂培養基（MHA）均購自北京路橋技術有限責任公司；革蘭氏染色試劑盒購自雷根生物；藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司；大腸桿菌成套生化鑒定管（DCSN）購自海博生物；大腸埃希氏菌診斷血清、常見的30種大腸桿菌抗原血清購自寧波天潤生物有限公司。

1.3 試驗動物

Balb/c小鼠18～20 g，60只，由山東大學實驗動物中心提供。

1.4 細菌的分離純化培養

在無菌超凈工作臺內將采集的病料采用四區劃線法接種于麥康凱培養基上，37℃培養過夜后，挑取粉紅色的疑似大腸桿菌菌落接種至普通培養基上純化，挑取純化后的疑似大腸桿菌同時接種至伊紅美藍培養基和SS培養基上，觀察菌落生長情況，篩選出符合大腸桿菌細菌學形態的菌株。對篩選出的菌株進行革蘭氏染色，鏡檢，取革蘭氏染色反應符合大腸桿菌特征的菌株用進行大腸桿菌生化鑒定。

1.5 大腸桿菌生化鑒定

按照腸桿菌成套生化鑒定管（DCSN）說明書操作。

1.6 大腸桿菌血清型鑒定

將純化后的待檢大腸桿菌菌株接種于營養瓊脂斜面，37℃恒溫培養24 h后，用無菌生理鹽水洗滌、離心重復2次制成濃菌液，用大腸桿菌標準血清對所分離到的大腸桿菌進行血清型鑒定，操作按照說明書進行。

1.7 分離菌的16S rDNA PCR鑒定

挑取純化后的典型單個菌落接種到MHB中，200 r/min 37℃恒溫震蕩培養12 h形成種子液，再按1%比例進行接種至MHB中繼續搖菌4～6 h，用煮沸法快速制作DNA模板，然后進行PCR擴增16S rDNA基因，引物為16S rDNA通用引物。反應條件：94℃4 min；94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，35次循環；72℃10 min。PCR產物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，預擴增片段1 467 bp。PCR產物由上海生工生物工程技術服務有限公司測序，序列結果用NCBI Blast搜索比對，鑒定標準按照同源性≥97%判定。

1.8 致病性試驗

篩選出為致病性血清型的大腸桿菌分別挑取單個菌落接種至5 mL普通肉湯培養基中，37℃恒溫震蕩（200 r/min）12 h為種子液，然后按1%比例將種子液接種至MHB中，繼續37℃震蕩培養4～6 h，檢測OD值稀釋細菌約109CFU/mL后對小鼠進行腹腔注射，每株菌注射3只，每只注射0.5 mL；同時設置空白對照組，用等量無菌生理鹽水代替菌液腹腔注射小鼠，觀察小鼠1周內的發病以及死亡情況。對死亡小鼠進行剖檢，觀察病理變化，并且在無菌條件下采集肝臟組織分離檢測細菌。

1.9 藥敏試驗

用分離到的致病菌株進行藥敏試驗，按照常規藥敏紙片擴散法進行操作，每株菌的藥敏試驗做3次重復，以沒有明顯肉眼可見物區域為抑菌圈邊緣，用標尺準確測量抑菌圈直徑大小，每種藥敏試紙片抑菌圈的大小取3次重復的平均值。判斷標準參照美國臨床實驗室標準委員會（NCCLC）標準，級別分為耐藥（R）、中度敏感（I）和高度敏感（S）。判斷標準為抑菌圈直徑≤10 mm為不敏感即耐藥，10 mm＜抑菌圈直徑＜20 mm為中度敏感，抑菌圈直徑≥20 mm為高度敏感。

藥敏片藥敏片選用常用的10種抗菌藥敏片：氧氟沙星（OFX，5 μg）、頭孢曲松（CRO，30 μg）、克拉霉素（CLA，15 μg）、阿米卡星（AMK，30 μg）、大觀霉素（SH，100 μg）、林可霉素（MY，10 μg）、環丙沙星（CIP，5 μg）、青霉素（P，10 μg）、阿莫西林（AMX，10 μg）、頭孢唑啉（KZ，30 μg）。

2 結果與分析

2.1 細菌分離與培養

從采集的病料中共分離具有以下特征的細菌：麥康凱培養基上生長呈粉紅色菌落；挑取以上疑似的典型菌落，接種在普通瓊脂平板上進行純化，生長均呈灰白色、半透明、表面隆起、光滑濕潤、邊緣整齊的圓形菌落；純化后的菌落接種至伊紅美藍培養基和SS培養基上，篩選出在伊紅美藍培養基中生長呈現金屬光澤，以及在SS培養基上生長呈現粉紅色菌落的23株細菌，然后經涂片、染色、鏡檢，均可見形態一致的兩端鈍圓、中等大小的革蘭氏陰性桿菌，見圖1。

2.2 細菌生化鑒定

經生化鑒定篩選出的23株疑似大腸桿菌均為大腸桿菌。

2.3 致病性試驗

將篩選出的23株大腸桿菌以109CFU/mL濃度對Balb/c小鼠進行腹腔注射接種，23株細菌均致小鼠死亡，陰性對照組小鼠健康，說明均為致病菌株。剖檢病鼠可見肝臟肺臟充血、小腸出血等病理變化（圖2和圖3）。無菌條件下采取發病死亡小鼠肝臟組織進行細菌分離，經鑒定均為大腸桿菌。

2.4 大腸桿菌血清型鑒定結果

采用玻板凝集試驗，對分離的23個致病菌株進行鑒定分型。結果顯示，分離株血清型分屬于9種血清型，其中優勢血清型是O157、O113，優勢血清型菌株分別占已鑒定菌株的 30.4%（7/23）、21.7%（5/23）。

2.5 16S rDNA基因的PCR擴增與測序

將PCR產物通過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用凝膠成像儀可看到菌液樣品在1 000 bp和2 000 bp間出現條帶，與預期的目的片段大小（1 467 bp）相符（圖4）。

將PCR產物送上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序，序列比對結果表明，所有菌株的擴增序列與GenBank中大腸桿菌參考株16S rDNA基因序列的同源性均達到99%。

2.6 藥敏試驗

選用目前臨床上常用的10種抗菌藥對23株大腸桿菌進行藥敏試驗，結果發現，同時對3種及以上抗菌藥耐藥的多重耐藥分離菌株占87.0%（20/23）。抑菌效果的判定參考中華人民共和國衛生行業標準WS/T 650—2019，此處統計高度敏感和中度敏感菌株數量，得出結果抑菌效果較好的藥物主要有阿米卡星（21/23，91.3%）、頭孢曲松（20/23，87.0%）、大觀霉素（20/23，86.9%）；此外產生高水平耐藥性的藥物主要有林可霉素、青霉素和阿莫西林，耐藥率分別為 87.0%（20/23）、82.6%（19/23）、69.6%（16/23）。藥敏試驗結果見表1、表2。

表1 大腸桿菌分離株藥敏試驗的抑菌圈直徑 mm

表2 大腸桿菌分離株的藥敏試驗結果

3 討論與小結

本試驗分離的大腸桿菌菌株來源于某市7家規模豬場中的發病腹瀉仔豬的直腸內容物。分離出的24株疑似大腸桿菌中23株為大腸埃希氏菌，鑒定血清型多達7種，其中O157、O113為主要流行血清型。本試驗的藥物敏感性試驗檢測耐藥性[5-6]結果顯示，分離得到的大腸桿菌的耐藥性已明顯顯現，其中抑菌效果較好的主要有阿米卡星、頭孢曲松和大觀霉素；產生耐藥性的藥物主要有林可霉素、青霉素和阿莫西林，同時結果顯示同時對3種及以上的抗菌藥物存在耐藥性的分離菌株數量高達87.0%（20/23）。此項研究表明，該區域腹瀉仔豬致病大腸桿菌主要以O157、O113為優勢血清型，普遍存在抗藥性，且耐藥種類多樣，抗藥水平較高。這種現象的產生與豬場慣用抗菌方法有很大關系。因此為了更好地了解豬場細菌性疾病發展情況以及耐藥情況，應定期收集病料進行流行病學調查和耐藥性分析[7]，結合抗菌藥物應用原則合理用藥[8]，做到抗菌效果的優化，避免耐藥菌株的產生。

此外仔豬大腸桿菌病發病與氣候、溫度、飼養管理方式以及飼養環境有相當大的關聯性，例如圈舍潮濕陰冷、飼養管理模式不合理、飼養環境衛生不達標都會導致大腸桿菌病的發生。因此做好圈舍管理、飼養管理、環境控制是防控本病的重要手段[9]。