復合菌分步發酵大豆皮對其抗營養因子降解效果的影響

彭 翔，韓 麗，張廣民，嚴 峰，李 陽，王海燕，蔡輝益，2

（1.北京挑戰生物技術有限公司，北京 海淀 100081；2.中國農業科學院飼料研究所，北京 海淀 100081）

隨著我國玉米、豆粕等常規飼料原料資源緊缺，越來越多的飼料企業大量使用價格低廉的非常規飼料原料，包括農作物秸稈、麩皮、大豆皮、統糠等。在這些非常規飼料原料中，農作物秸稈營養價值低，不利于畜禽生長；麩皮粗纖維含量較高，但膳食纖維含量相對較低，含水量較高，不利于儲存，且霉菌毒素含量超標；統糠木質素含量高，不易消化，且易劃傷畜禽腸道。而大豆皮作為新型的膳食纖維飼料原料，具有木質素含量低、膳食纖維含量高、且霉菌毒素含量少等優勢（胡金杰等，2015）[1]，其水分含量低于10%，木質素含量低于2%，粗纖維約37%，膳食纖維約75%，粗蛋白質約12%，其干物質消化率高達90%，與農作物秸稈、麩皮、統糠等非常規飼料原料相比，具有較好的使用優勢。有報道稱，大豆皮作為較好的纖維飼料原料，可在豬后腸發酵產生短鏈脂肪酸為機體提供能量，提高飼料中的營養物質利用率，促進家畜生長等（胡金杰等，2015）[1]；大豆副產物中的異黃酮可增加母豬產活仔數，提高動物的繁殖性能，同時在解決母豬便秘和仔豬腹瀉等問題上發揮著重要的作用（曲強，2018）[2]。但由于大豆皮中含有球蛋白、β-伴大豆球蛋白和胰蛋白酶抑制因子等多種抗營養因子，導致其利用率低，動物生長減緩，使其在養豬業上的生產應用受到一定限制。采用微生物發酵法去除抗營養因子是目前國內外研究的熱點（Wang等，2014）[3]。有報道稱，微生物發酵大豆副產物可消除其抗營養因子，并產生多肽、乳酸、消化酶、維生素等多種活性物質，提高原料營養價值（謝益根等，2016）[4]。因此，本研究采用固體發酵技術考察耗氧和厭氧相結合的發酵模式來發酵大豆皮，旨在研究此發酵工藝模式對大豆皮中抗營養因子降解效果、發酵大豆皮產品品質和產品穩定性的影響，并篩選出較佳的發酵參數，以提高大豆皮的營養價值和飼用價值，為開發功能性膳食纖維發酵飼料提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗時間與地點

試驗于2019年8—12月在天津市薊州區挑戰集團研究院進行。

1.2 試驗材料

試驗用菌主要有枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌、釀酒酵母菌，均由北京挑戰生物技術有限公司提供。試驗用大豆皮由秦皇島金海糧油工業有限公司提供。試驗用培養基包括胰蛋白胨、酵母浸出粉、氯化鈉、葡萄糖、MRS培養基、碳源（糖蜜）、氮源（尿素）等。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗設計 復合菌分步發酵大豆皮主要包括第1階段的耗氧發酵和第2階段的厭氧發酵大豆皮。其中第1階段耗氧發酵大豆皮工藝的篩選和優化主要包括發酵劑組合（碳源和氮源添加比例）和單菌發酵大豆皮工藝條件的篩選和優化（包括發酵時間、溫度、含水量和接種量等），其主要檢測指標包括球蛋白、β-伴大豆球蛋白和胰蛋白酶抑制因子降解率等指標，并根據上述指標的發酵效果確定較佳的大豆皮發酵工藝參數。第2階段厭氧發酵大豆皮主要是第1階段耗氧發酵結束后，接種植物乳桿菌和釀酒酵母菌進行厭氧發酵，以改善發酵料氣味和發酵大豆皮品質，主要檢測指標包括乳酸和pH等。

1.3.2 指標測定及檢測方法 按照GB/T 6435—2014的方法進行干物質測定；按照GB/T 6432—2018的方法進行粗蛋白質測定；按照GB/T 8622—2006的方法進行脲酶活性測定；按照ELISA（酶聯免疫吸附試驗）檢測試劑盒（由北京龍科方舟生物工程技術有限公司提供）說明進行抗營養因子（球蛋白、β-伴大豆球蛋白和胰蛋白酶抑制因子）的快速定量檢測及計算；采用生物傳感分析儀進行乳酸含量測定；采用pH計進行發酵料pH測定。

1.3.3 菌株活化 將實驗室保存的枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌和釀酒酵母菌菌種按1%體積分別接種于LB培養基、MRS培養基或PDA培養基中，37℃或30℃活化22 h后，按同樣的方式進行二次擴培，獲得多種菌株的菌液并調OD值，且對稀釋好的菌液進行涂板計數，確定菌量，備用。

1.3.4 發酵劑組合中氮源和碳源添加比例的篩選在待發酵大豆皮中接種10%的芽孢桿菌菌株，并補充不同添加比例的氮源和碳源（3∶1、10∶3、4∶1、15∶4和5∶1），混合均勻后，裝入三角瓶中，加蓋封口膜，置于恒溫培養箱中37℃耗氧發酵72 h，發酵結束后按照GB/T 14699.1—2005采樣，于55℃烘干粉碎，用于發酵大豆皮中抗營養因子指標的測定。最后根據測定結果進而篩選較佳的碳源和氮源添加比例。

1.3.5 耗氧發酵大豆皮工藝條件的篩選和優化 根據1.3.4篩選結果進行第1階段的耗氧發酵大豆皮的發酵時間（24 h、48 h和 72 h）、發酵溫度（37℃、30℃、25℃）、含水量（50%、45%和 40%）、接種量（0.1%、1%和10%）等發酵參數的篩選和優化。其中，以發酵時間48 h、發酵溫度37℃、含水量45%、接種量1%為耗氧發酵試驗開始時的基礎參數，發酵結束后，測定發酵大豆皮中抗營養因子含量，并計算其降解率，后期試驗根據前期試驗所得結果進行相關單因素調整。

1.3.6 厭氧發酵大豆皮工藝條件的篩選和優化 待第1階段耗氧發酵結束后，向發酵大豆皮中接種植物乳桿菌和釀酒酵母菌繼續進行厭氧發酵。其中，根據前期實驗室研究結果，設定發酵溫度為30℃，植物乳桿菌與釀酒酵母菌接種比例為100∶1，并對發酵時間（24 h、48 h和72 h）進行篩選和優化，厭氧發酵結束后，測定發酵產物中乳酸含量和pH，并觀察發酵料顏色和氣味，確定較優的厭氧發酵工藝參數。

1.4 統計分析

試驗數據采用Excel 2010進行數據統計，用SPSS 18.0軟件進行單因素方差分析和多重比較，數據均以平均值±標準誤表示，其中P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同碳氮比對大豆皮抗原蛋白降解效果的影響

由表1可知，固態發酵試驗中，在大豆皮發酵體系中加入不同比例的碳源和氮源發現，大豆皮發酵結束后，碳氮比為15∶4時，其球蛋白、β-伴大豆球蛋白和胰蛋白酶抑制因子降解率與其他組相比相對較好（P<0.05），其降解率分別為92.90%、86.29%和79.87%。因此，選用碳氮比為15∶4進行接下來的試驗。

2.2 耗氧發酵工藝條件對其抗原蛋白降解效果的影響

由表2可知，通過測定不同發酵時間（24 h、48 h和72 h）發酵大豆皮中抗營養因子發現，發酵48 h和72 h時大豆皮抗營養因子降解率顯著高于發酵24 h（P<0.05），且發酵72 h大豆皮抗營養因子降解率顯著高于發酵48 h（P<0.05），但從抗營養因子含量上看兩者差異不大。因此，為了縮短發酵時間，減少生產成本，后期試驗選擇發酵大豆皮48 h為宜。

表1 不同碳源和氮源組合對大豆皮抗營養因子降解效果的影響

表2 耗氧發酵對大豆皮抗原蛋白降解效果的影響

通過測定不同發酵溫度（37℃、30℃和25℃）對大豆皮抗營養因子降解效果的影響發現，隨著發酵溫度的提高，其球蛋白、β-伴大豆球蛋白和胰蛋白酶抑制因子降解率逐漸升高，且三者間差異顯著（P<0.05），尤其以發酵溫度為37℃發酵效果較優。

通過測定不同發酵含水量（40%、45%和50%）對大豆皮抗營養因子降解效果的影響發現，隨著發酵體系含水量的不斷增加，其球蛋白、β-伴大豆球蛋白和胰蛋白酶抑制因子降解率逐漸升高，且三者間存在顯著差異（P<0.05），尤其以發酵含水量為50%時發酵效果較優。

通過測定發酵大豆皮不同接種量（0.1%、1%和10%）對大豆皮抗營養因子降解效果的影響發現，隨著發酵大豆皮接種量的不斷增加，其球蛋白、β-伴大豆球蛋白和胰蛋白酶抑制因子降解率隨之增加（P<0.05），以發酵體系10%接種量發酵效果較優，但從抗營養因子含量上看，接種量10%與接種量1%差異不明顯，又考慮菌種成本，因此選擇后期發酵試驗接種量1%為宜。

2.3 厭氧發酵工藝條件對大豆皮發酵效果的影響

本試驗根據2.2篩選結果進行耗氧發酵，并在耗氧發酵結束的發酵大豆皮中接種植物乳桿菌和釀酒酵母菌繼續進行厭氧發酵。由表3可知，大豆皮耗氧發酵結束后，其球蛋白、β-伴大豆球蛋白、胰蛋白酶抑制因子降解率分別為86.60%、85.04%和82.76%。脲酶活性由0.85 U/g降低至0.10 U/g。

表3 耗氧發酵對大豆皮抗營養因子降解效果的影響（n=6）

由表4可知，隨著厭氧發酵時間的延長，發酵產物中乳酸含量不斷增加，pH不斷降低，且厭氧發酵48 h和72 h乳酸含量和pH顯著優于厭氧發酵24 h（P<0.05），但從兩者數值上看，厭氧發酵48 h與72 h變化幅度不大，因此考慮成本選擇厭氧發酵48 h為宜。

表4 厭氧發酵不同發酵工藝參數對大豆皮發酵效果的影響（n=6）

3 討論

大豆皮主要成分是纖維和果膠，其營養組成比較單一，含氮物質較少，不利于發酵菌株的生長，而碳源和氮源是微生物生長所必須的營養物質（張開磊等，2015）[5]。因此，本試驗研究了不同碳氮比對大豆皮抗營養因子降解效果的影響，結果發現，隨著大豆皮發酵體系中碳氮比的增加，其抗營養因子降解率呈先升高后降低的趨勢，尤其當碳氮比為15∶4時，發酵大豆皮中抗營養因子降解率較高。這可能是此碳氮比更有利于發酵菌株的生長和代謝。另外發現，隨著尿素水平的增加，發酵大豆皮中有明顯的刺鼻性氣味。可見，尿素添加水平過高將會影響發酵大豆皮的產品品質。

微生物發酵過程中可產生多種消化酶和有益活性成分，以改善發酵原料的營養物質利用率和飼用價值。而微生物發酵參數和生產工藝是影響微生物生長繁殖、發酵飼料產品質量和產品穩定性的主要因素（高斐斐等，2015）[6]。其中，發酵溫度是影響發酵料發酵效果和微生物的生長及其代謝產物合成的關鍵控制點。本研究發現，隨著發酵溫度的升高，其抗營養因子降解率逐漸升高，尤其大豆皮發酵溫度為37℃時其發酵效果較優。這與袁正武等研究結果基本一致（袁正武等，2015）[7]。這可能是因為最適發酵溫度受發酵底物和發酵菌種等因素的影響，不同菌種在不同溫度下生長代謝狀況不同，而在此溫度條件下枯草芽孢桿菌產酶能力較強，有利于大豆皮中抗營養因子的降解（李錫閣等，2019）[8]。

發酵體系含水量與發酵菌種和發酵原料等直接相關，其適宜含水量不僅有利于微生物生長及其代謝產物的產生，還能保證發酵飼料的發酵效果。本研究中隨著發酵體系含水量的增加，其抗營養因子降解率呈逐漸增加的趨勢，尤其以50%含水量發酵效果最優，這與李錫閣等和王金斌等研究結果基本一致（李錫閣等，2019；王金斌等，2009）[8-9]。這可能是因為微生物發酵過程中可使發酵原料中的碳水化合物等物質分解，產生一些黏性物質，使底物黏連，而隨著發酵體系水分的不斷增加，這種底物黏連作用減弱；又因為高水分環境適合枯草芽孢桿菌生長，隨著其活性的增強，有利于其代謝產生降解抗營養因子的酶類。

發酵菌種接種量影響原料發酵過程中微生物之間的動態平衡，而適宜的接種量不僅可抑制發酵體系中雜菌的生長，同時還可縮短發酵周期，提高微生物代謝產物的產生量，進而改善發酵飼料的產品品質。本研究發現，隨著發酵大豆皮接種量的不斷增加，其抗營養因子降解率隨之增加，但從抗營養因子含量上看，接種量10%與接種量1%差異不大。這說明接種量為1%時就可達到預期發酵效果，還可降低菌種使用成本。這與Seo等（2016）[10]研究結果基本一致。這可能是由于芽孢桿菌在發酵過程中產生了大量的蛋白酶，降解了大豆皮中大多的抗營養因子。

發酵時間可影響芽孢桿菌菌株的生長和產物酶的活性。本研究發現，隨著發酵時間的延長，發酵大豆皮中抗營養因子降解率逐漸升高，尤其發酵72 h時其抗營養因子降解率達到最高，這可能是因為微生物對大豆皮的發酵主要依賴于其所產生的各種酶類，而隨著發酵時間的延長，枯草芽孢桿菌生長并產生了較多的功能性酶，降解了其中的抗營養因子，提高其飼料利用率（Dai等，2019）[11]。另外，本研究還發現，發酵72 h時其抗營養因子含量與發酵48 h變化不大，這說明延長發酵時間對其抗營養因子含量無明顯變化。這可能是因為枯草芽孢桿菌屬于好氧菌，隨著發酵時間的延長，發酵體系中氧氣的缺乏導致芽孢桿菌菌株減少，從而影響蛋白酶的分泌。由于固體耗樣發酵時間過長可能會有染霉風險，不利于儲存，且適口性差，生產成本較高。因此，如何提高發酵料產品品質是接下來的研究方向。

有報道稱，乳酸菌發酵過程中產生的酶類可降解碳水化合物，并產生細菌素、乳酸和其他有機酸等物質，不僅能抑制有害菌生長，降低發酵體系pH，提高酸度，減少染雜菌風險；還能改善動物腸道健康，增強腸道功能（魏炳棟等，2014）[12]。本研究中大豆皮經乳酸菌和酵母菌厭氧發酵后，其在發酵0～48 h乳酸含量和pH均變化迅速，而后趨于穩定，且氣味和適口性均明顯改善，可減少雜菌污染，提高產品穩定性，延長產品儲存時間。這與魏炳棟等（2014）[12]和劉國娟等（2014）[13]研究結果基本一致。這可能是因為植物乳桿菌和釀酒酵母菌可利用發酵過程中產生的單糖或二糖等，產生有機酸、醇類或酯類等酸香味物質，降低了發酵大豆皮體系pH，抑制了雜菌的生長，起到提高發酵飼料的誘食性，改善發酵料產品品質的作用（魏炳棟等，2014）[12]?？梢?，在發酵體系中接種乳酸菌和酵母菌進行厭氧發酵可解決發酵料適口性和產品穩定性等問題。

4 結論

在本試驗條件下，采用復合菌分步發酵模式，綜合研究了不同碳氮比和發酵參數對抗原蛋白降解情況的影響，發現碳氮比為15∶4，耗氧發酵工藝參數為發酵時間48 h、發酵溫度37℃、含水量50%，枯草芽孢桿菌接種量1%時，其對大豆皮發酵效果較優，可有效消除其抗營養因子，提高其飼用價值；厭氧發酵工藝參數為植物乳桿菌∶釀酒酵母菌為100∶1，發酵時間48 h，發酵溫度30℃，其可改善發酵飼料氣味和適口性，減少染霉風險，且提高了發酵料品質和產品穩定性，可作為優質功能性膳食纖維發酵飼料應用于動物生產中，以實現大豆皮高效利用。