抗突變型瓜氨酸波形蛋白抗體在類風濕關節炎診斷中的應用

楊莉娟 陳楚濤 張學培 馬劍達 李紅瑰 鄭東輝 戴冽

【關鍵詞】抗突變型瓜氨酸波形蛋白抗體;類風濕因子;抗環瓜氨酸肽抗體;類風濕關節炎

類風濕關節炎（RA）是一種常見的慢性炎癥性自身免疫性疾病，以滑膜炎和受累關節進行性、不可逆性破壞為特征，目前臨床尚不能根治，因此早期診斷與早期治療對避免RA患者病情加重、出現不可逆的關節損害尤為重要[1]。血清自身抗體是診斷RA的重要實驗室指標。從最早的RF到目前臨床廣泛使用的抗環瓜氨酸肽（CCP）抗體都是納入RA診斷標準的自身抗體，對RA的診斷有重要價值[2]。然而，目前即使通過聯合檢測RF和抗CCP抗體提高RA診斷的靈敏度，仍有10%～20%的RA患者血清中檢測不到相應的自身抗體，導致這部分血清陰性的RA患者可能被漏診[3]。因此尋找新的RA相關甚至特異的自身抗體是目前風濕性疾病領域實驗室診斷的研究熱點。有研究顯示，瓜氨酸化波形蛋白為抗Sa抗體的靶抗原，抗突變型瓜氨酸波形蛋白（MCV）抗體屬于抗環瓜氨酸抗體譜的成員之一，是一種較新的診斷RA靈敏度與特異度均較高的血清學指標[4-5]。本研究擬利用前瞻性隊列中RA患者的基線血清，探討抗MCV抗體在RA診斷中的應用。

對象與方法

一、研究對象

前瞻性隊列為2014年11月至2018年7月就診于中山大學孫逸仙紀念醫院門診及住院的RA患者，診斷符合1987年美國風濕病學會（ACR）修訂的RA分類標準或2010年ACR與歐洲風濕病學會（EULAR）聯合修訂的早期RA分類標準[6-7]。排除合并其他風濕性疾病（如SLE、系統性硬化病、皮肌炎等）、合并嚴重感染、器官功能衰竭或惡性腫瘤的患者以及不愿意配合的患者。本研究獲得中山大學孫逸仙紀念醫院倫理委員會批準，所有參與本研究的受試者均簽署知情同意書。

二、臨床資料收集

收集所有患者基線的臨床資料，包括年齡、性別、病程、疼痛視覺模擬評分（VAS，0～10cm）、28個壓痛關節數（28TJC）、28個腫脹關節數（28SJC）、患者總體病情活動度評估（PtGA，0～10cm）、醫生總體病情活動度評估（PrGA，0～10cm）、ESR（魏氏法，女性0～20mm/h，男性0～15mm/h）、CRP（散射比濁法，0～5mg/L）等，并計算病情活動度，包括28個關節疾病活動度評分（DAS28-CRP）、簡化的疾病活動指數（SDAI）和臨床疾病活動指數（CDAI）。根據DAS28-CRP，將RA病情活動度分為4個等級：DAS28-CRP<2.6為緩解期，DAS28-CRP2.6～3.1為低度活動期，DAS28-CRP3.2～5.1為中度活動期，DAS28-CRP>5.1為高度活動期。

三、RF、抗CCP抗體和抗MCV抗體的檢測及分組

在收集所有患者臨床資料的同時采集其外周靜脈血5ml，分離血清、凍存。自身抗體的檢測：RF采用散射比濁法檢測（德國西門子公司），正常值范圍為0～20U/ml。抗CCP抗體采用ELISA檢測（德國AESKU公司），正常值范圍為0～18RU/ml，檢測濃度上限為300RU/ml。抗MCV抗體采用ELISA定量檢測（德國ORGENTEC公司），正常值范圍為0～20U/ml，檢測濃度上限為1000U/ml。

根據2010年早期RA分類標準中的血清學評分標準，抗體水平升高但不超過3倍正常上限定義為抗體低滴度陽性，若超過3倍正常上限定義為抗體高滴度陽性[7]。因此，RF20～60U/ml定義為RF低滴度陽性，RF>60U/ml定義為RF高滴度陽性;抗CCP抗體18～54RU/ml定義為抗CCP抗體低滴度陽性，抗CCP抗體>54RU/ml定義為抗CCP抗體高滴度陽性。同時，我們將抗MCV抗體20～60U/ml定義為抗MCV抗體低滴度陽性，抗MCV抗體>60U/ml定義為抗MCV抗體高滴度陽性。

四、統計學處理

采用SPSS25.0進行統計學處理。服從正態分布的連續變量以表示。不服從正態分布的連續變量以中位數（下四分位數，上四分位數）表示。分類變量以例（%）表示，不同抗體陽性率的比較采用配對χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

結果

一、RA患者的一般特征

共納入148例RA患者，其中116例（78.4%）為女性，年齡為（46.3±12.5）歲，病程為48（12，96）月，26例（17.6%）為DAS28-CRP緩解期，122例（82.4%）為DAS28-CRP活動期，其中20例（13.5%）為輕度活動、72例（48.6%）為中度活動、30例（20.3%）為高度活動，見表1。

二、RA患者自身抗體陽性的分布及陽性率的比較

148例RA患者RF、抗CCP抗體和抗MCV抗體陽性的分布情況見表2，不同的RA患者3種自身抗體的陽性分布不完全一致。RF陽性率為72.3%（107/148），抗CCP抗體陽性率為74.3%（110/148），抗MCV抗體陽性率為77.7%（115/148），3組不同自身抗體陽性率組間比較差異無統計學意義（RF與抗CCP抗體陽性率比較χ2=0.129，P=0.720;RF與抗MCV抗體陽性率比較χ2=1.633，P=0.200;抗CCP抗體與抗MCV抗體陽性率比較χ2=0.516，P=0.473）。

三、抗MCV抗體對1987年RA分類標準的補充價值

148例RA患者中，RF陰性的患者41例。在41例RF陰性的RA患者中，抗CCP抗體的陽性率為41.5%（17/41），抗MCV抗體的陽性率為46.3%（19/41），兩者比較差異無統計學意義（P=0.791）。在RF陰性且再次檢測抗CCP抗體仍為陰性的血清學陰性的24例RA患者中，抗MCV抗體的陽性率為33.3%（8/24），見圖1。

四、RA患者自身抗體滴度的比較

148例RA患者中，RF、抗CCP抗體和抗MCV抗體的低滴度陽性率分別為19.6%（29/148）、19.6%（29/148）和12.2%（18/148）。3組不同自身抗體低滴度陽性率比較差異無統計學意義（RF與抗CCP抗體低滴度陽性率比較χ2=0.000，P=1.000;RF與抗MCV抗體低滴度陽性率比較χ2=2.564，P=0.108;抗CCP抗體與抗MCV抗體低滴度陽性率比較χ2=2.951，P=0.117）。RF、抗CCP抗體和抗MCV抗體的高滴度陽性率分別為52.7%（78/148）、54.7%（81/148）和65.5%（97/148），其中抗MCV抗體的高滴度陽性率高于RF高滴度陽性率（χ2=6.811，P=0.013）和抗CCP抗體的高滴度陽性率（χ2=4.923，P=0.036），見圖2。

五、抗MCV抗體對2010年早期RA分類標準的補充價值

24例RF和抗CCP抗體均陰性的血清學陰性RA患者中，抗MCV抗體低滴度陽性和高滴度陽性的患者分別占8.3%（2/24）和25.0%（6/24）。22例RF或抗CCP抗體至少1個低滴度陽性且均無高滴度陽性的患者中，抗MCV抗體低滴度陽性和高滴度陽性的患者分別占9.1%（2/22）和59.1%（13/22），見圖3。

討論

RA是以外周關節受累為主的慢性自身免疫性疾病，發病2年即可造成關節軟骨和骨質破壞，最終導致關節畸形，因此對RA進行早期診斷并采取有效治療措施對延緩疾病進展、改善預后具有重要意義。目前診斷RA主要依靠臨床表現、血清學指標及X線。然而，RA患者關節出現X線改變往往需要幾個月甚至更長時間，關節軟骨通常已達到不可逆損害，而在RA早期甚至在出現臨床癥狀前血清學即可檢出RA特征性或相關性的自身抗體，且血清學檢測經濟方便，因此血清學指標的檢測對RA的早期診斷具有重要意義[2，8]。

波形蛋白是一種主要在中胚層起源的細胞中表達的細胞骨架蛋白，其在凋亡的巨噬細胞內由肽酰精氨酸脫亞氨酶的作用下發生瓜氨酸化，這個過程改變了蛋白結構并增加了其潛在的抗原決定簇瓜氨酸。波形蛋白在凋亡細胞內分解后成為核周聚集物，若不能及時清除而持續存在，則啟動自身免疫應答，促使抗MCV抗體的生成。突變型的波形蛋白有額外精氨酸殘基插入，增加了被瓜氨酸化的潛在位點。目前已發現有多達45個可被瓜氨酸化的位點，可以更有效地與其特異性抗體結合，提高了檢測的靈敏度和特異度，因此抗MCV抗體逐漸成為一種新興的輔助診斷RA的血清學指標[5，9-10]。

RF是最早用于診斷RA的自身抗體，RF陽性是1987年ACR修訂的RA分類標準中的重要診斷指標之一，然而約25%的RA患者血清RF陰性。本研究中有27.7%的RA患者RF陰性，與既往研究相似[4，6]。RF因在其他自身免疫性疾病（如SLE、干燥綜合征等）、腫瘤、結核病甚至正常的老年人群中也會出現陽性，對RA診斷的特異度較差，限制了其在臨床診斷中的價值，臨床需要不斷開發新的特異度更高的診斷RA的自身抗體[11]。

抗CCP抗體是存在于RA患者血清中的另一類自身抗體，在RA診斷中具有與RF相似的靈敏度，但特異度更高[12]。抗CCP抗體最早可以在RA患者出現臨床癥狀前14年的血清中出現陽性，平均在RA患者出現臨床癥狀前4.5（0.1～13.8）年可檢測到陽性，因此是RA早期診斷理想的檢測指標[13]。1987年ACR分類標準主要適用于長病程的RA患者，對早期RA患者的診斷有明顯的局限性。2010年的RA分類標準將抗CCP抗體和RF共同作為RA血清學診斷依據，適合于早期RA的診斷[7，14]。雖然血清RF和抗CCP抗體聯合檢測大大提高了RA診斷的靈敏度和特異度，仍有10%～20%的患者血清RF和抗CCP抗體均陰性，即血清學陰性RA[3]。我們的研究中有25.7%的RA患者RF陰性，16.2%的RA患者RF和抗CCP抗體均陰性，這些患者的診斷是臨床的難點。

抗MCV抗體和抗CCP抗體雖然都是抗瓜氨酸蛋白抗體家族的成員，均具有抗原決定簇瓜氨酸。然而，抗CCP的抗原決定簇是人工合成的，分子量僅為波形蛋白的1/20，可被瓜氨酸化的位點少，而抗MCV抗體的靶抗原是具有多個可被瓜氨酸化的天然波形蛋白，從理論上講較抗CCP抗體具有更高的靈敏度和特異度[15]。一項納入了12個中心研究的Meta分析顯示，抗MCV抗體對RA診斷的靈敏度為68.6%，高于抗CCP抗體的靈敏度（61.7%，P<0.001）[16]。本研究顯示，抗MCV抗體在RA患者中的陽性率為77.7%，這與國外Mansour等[17]報道的抗MCV抗體對RA診斷的靈敏度79.6%的結果一致。本研究還顯示，抗MCV抗體在RF陰性的RA患者中的陽性率可達46.3%，而在RF和抗CCP抗體均為陰性的血清學陰性RA患者中的陽性率也有33.3%，提示對于臨床上疑似RA但目前診斷標準中推薦的血清自身抗體均陰性情況下，可進一步檢測抗MCV抗體，提高RA患者的檢出率，減少臨床漏診。

RF和抗CCP抗體的水平越高，與RA的相關性越大，因此2010年的RA分類標準進一步將RF和抗CCP抗體分為高、低滴度，并賦予不同的診斷分值[7，18]。在芬蘭人群中進行的一項大樣本隊列研究中，發現抗MCV抗體在早于診斷RA前11年就可在患者血清中檢測到，并且高滴度的抗MCV抗體增加了后期發展為RA的風險[19]。本研究顯示，本組RA患者抗MCV抗體的高滴度陽性率可達65.5%，高于RF和抗CCP抗體的高滴度陽性率，并且在RF和抗CCP抗體均陰性（血清學評分0分）的RA患者中，抗MCV抗體低滴度陽性和高低度陽性的患者分別占8.3%和25.0%，而在RF或抗CCP抗體至少1個陽性且均無高滴度陽性（血清學評分2分）的RA患者中，抗MCV抗體低滴度陽性和高低度陽性的患者分別占9.1%和59.1%，提示進一步定量檢測抗MCV抗體水平可提高對RA患者的檢出率。但本研究為單中心研究，樣本量偏少，結果可能存在一定的偏倚，我們擬繼續擴大樣本量，進一步驗證抗MCV抗體對目前RA診斷的補充價值。

總之，抗MCV抗體對目前RA的診斷有一定的補充價值，尤其是對血清學陰性的患者，有望成為新的RA血清學輔助診斷指標，在臨床推廣應用。