三七多糖含量測定方法比較

蔡群虎 劉石磊 袁敏惠 王芬 胡會澤 張芳盛 郭霞 劉曉麗 辛文鋒

摘要：目的?通過比較硫酸苯酚法和硫酸蒽酮法在測定三七多糖時的優劣性，建立更準確的三七多糖含量測定檢測方法，為三七、三七剪口的多糖質量評價提供依據。方法?依次用80%乙醇和純水提取三七藥材，水提部分得到三七多糖，對所得多糖采用硫酸-苯酚法和硫酸-蒽酮法分別測量三七粗多糖的含量。結果?從精密度的角度來看，苯酚硫酸法較蒽酮硫酸法可靠（RSD=0.419<3.66）。從回收率的角度來看，使用苯酚硫酸法測定時，回收率更高（98.06>97.60）。結論?苯酚硫酸法為更準確測定三七粗多糖含量的檢測方法，此外，苯酚硫酸法還具有操作更簡便、安全、快捷等優點。

關鍵詞：三七粗多糖;硫酸苯酚法;硫酸蒽酮法;含量測定

中圖分類號：R285?文獻標志碼：A?文章編號：1007-2349（2020）08-0059-04

【Abstract】Objective： To establish a more accurate method for the determination and detection of notoginseng polysaccharide content by comparing the pros and cons of the sulfuric phenol method and the anthrone sulfate method in the determination of notoginseng polysaccharides and provide an evaluation basis for the quality of polysaccharides in notoginseng and notoginseng snip.?Methods： The medicinal materials of Panax notoginseng were extracted with 80% ethanol and pure water in sequence， and the polysaccharides of Panax notoginseng were obtained by water extraction.?The content of crude polysaccharides of Panax notoginseng was measured by the sulfuric acid-phenol method and the sulfuric acid-anthrone method.?Results： From a precision point of view， the phenol sulfuric acid method was more reliable than the anthrone sulfuric acid method （RSD=0.419<3.66）.?From the perspective of recovery rate， the recovery rate is higher when the phenol sulfuric acid method was used for determination （98.06>97.60）.?Conclusion： The phenol-sulfuric acid method is a more accurate method to determine the content of the crude polysaccharides of Panax notoginseng.?In addition， the phenol-sulfuric acid method is easier to operate， and safer and faster.

【Key words】crude polysaccharide of Panax notoginseng， phenol sulfate method， anthrone sulfate method， content determination

三七[Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen]，為五加科人參屬多年生草本植物，主要藥用部位為根部，產地主要為云南文山，廣西等地[1]。三七為我國的傳統名貴中藥材，主要用于治療外傷出血、咯血、吐血、便血、胸腹刺痛、跌打腫痛等[2]。三七皂苷為三七的主要活性成分，具有抗炎、抗腫瘤、提高免疫力、保護心血管、保肝保腎等藥理作用[3]。三七多糖是三七另一個活性成分，在藥材中含量為6%-10%左右[4]，無毒副作用[5]，藥理研究表明三七多糖具有增強機體免疫力的作用，具有一定的開發價值。為此本文對三七中的多糖提取物進行了含量測定，比較了硫酸苯酚法和硫酸蒽酮法在測定三七多糖時的優劣性，為建立更準確的三七多糖含量測定方法和質量評價提供了參考依據。

1?材料、儀器和試劑

1.1?材料與試劑?材料：三七剪口皂苷提取后藥渣干品所制得粗多糖（云科藥業和云南三七科技有限公司技術中心提供）;

試劑：無水乙醇、苯酚、濃硫酸、蒽酮（以上試劑均為分析純）;

標準曲線所用標準品：葡萄糖

1.2?儀器與設備?萬能粉碎機;電子天平（梅特勒）;電熱恒溫鼓風干燥箱（矛華DHG-9420）;HH-4數顯恒溫水浴鍋;型循環水真空泵;RE-2000A型旋轉蒸發儀;超聲波清洗器;紫外可見分光光度計（日歷）;雙光束紫外可見分光光度計（上海馳唐實業有限公司）;離心機（上海恒平）;真空干燥箱（瑪瑞特）。

2?方法與結果

2.1?苯酚硫酸法測定三七多糖含量

2.1.1?對照品溶液的制備?精密稱取0.0100 g單糖標準品，置于50 mL燒杯中，用超純水溶解，定容至100 mL容量瓶中，得對照品溶液。

2.1.2?三七粗多糖制備?精密稱取三七剪口粗粉10 g于500 mL圓底燒瓶中，加入80%的乙醇200 mL回流提取2 h，棄過濾液，藥渣再加入80%的乙醇200 mL回流提取1.5 h，棄過濾液，收集藥渣。將藥渣于60℃鼓風干燥箱揮干乙醇，加入純水熱回流提取2次，每次加入純水200 mL，每次提取2 h，合并兩次提取液，旋轉蒸真空濃縮到50 mL，攪拌加入400 mL無水乙醇醇沉8 h，過濾取沉淀，冷凍干燥得三七粗多糖。

2.1.3?三七粗多糖樣液的制備?精密稱取0.3 g粉碎后的三七粗多糖樣品于250 mL三角瓶中，向三角瓶中加入220 mL蒸餾水，加蓋保鮮膜，80℃水浴回流加熱2h，然后進行藥棉自然過濾，并將濾液轉入250 mL容量瓶中;將濾渣連同藥棉一同轉入燒杯中，加入20 mL蒸餾水，80℃水浴1 h，之后抽濾，合并兩次濾液，定容至250 mL容量瓶中。從容量瓶中取2 mL液體于燒杯中，加入無水乙醇10 mL使含醇量達到80%，冷藏1h，有沉淀析出，過濾收集沉淀，沉淀用水溶解25 mL定容，搖勻，即制得樣液。

2.1.4?3%苯酚溶液的配制?稱取3.0 g重蒸苯酚，加入96 mL超純水，于棕色瓶中，置于冰箱保存。

2.1.5?供試液的配制?準確吸取1 mL的“2.1.3”項下的多糖樣液，再加入“2.1.4”項下1 mL苯酚，4 mL濃硫酸，搖勻，反應10 min后，用冰水浴迅速冷卻至室溫，即得供試液。

2.1.6?標準曲線的繪制?準確吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.7 mL標準溶液于具塞試管中，加水補足1 mL，按“2.1.5”項下方法操作，在490 nm處測定其吸收值，以吸光度A為縱坐標，標準溶液濃度ρ為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程：A=13.333ρ-0.0229，R^2=0.9985，線性范圍為0.011～0.074 mg/mL。

2.1.7?精密度試驗?精密吸取三七粗多糖樣液1 mL，按“2.1.5”項下方法操作，在490 nm波長處測定吸收值，重復測定6次，相對標準偏差RSD為0.419%，結果見表1。

2.1.8?穩定性試驗?精密稱取三七粗多糖0.3 g，按“2.1.3”、“2.1.5”項下方法制備供試液，分別在10、20、30、40、50、60 min測定吸光度。相對標準偏差RSD為0.09%，表明加入苯酚、硫酸的供試溶液在60 min內穩定。結果見表2。

2.1.9?回收率試驗?精密吸取0.3 mL三七粗多糖樣液三份，分別加入0.1、0.2、0.3 mL標準溶液，按“2.1.5”項下方法操作，在490 nm處測定其吸光度，按公式計算加樣回收率，平均回收率98.06%，RSD=1.19%，所得結果見表3。

2.1.10?三七粗多糖的含量測定?精密吸取1 mL“2.1.3”項下樣液于具塞試管中，按“2.1.5”項下方法操作，在490 nm處測定其吸光度，根據吸光度從回歸方程求出樣品的含量，該批三七粗多糖平均含量是30.22%，RSD=0.7827%，結果見表4。

2.2?蒽酮硫酸法測定三七粗多糖含量

2.2.1?對照品溶液的制備?按“2.1.1”操作，即得對照品溶液。

2.2.2?三七粗多糖樣液的制備?按“2.1.2”“2.1.3”項操作，即得供試樣液。

2.2.3?蒽酮硫酸的配制?稱取0.33 g蒽酮，加100 mL濃硫酸，搖勻，置于棕色瓶中保存。

2.2.4?供試溶液的配制?準確吸取1 mL的“2.2.2”項下的多糖樣液，再加入“2.2.3”項下的4 mL蒽酮硫酸，快速置于冰水浴中搖勻，然后置于沸水浴中加熱10min，觀察顏色變化，之后用冰水浴迅速冷卻至室溫，即得供試液。

2.2.5?標準曲線的繪制?準確吸取0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.0 mL標準溶液于具塞試管中，加水補足1 mL，按“2.2.4”項下方法操作，在620 nm處測定其吸收值，以吸光度A為縱坐標，標準溶液濃度ρ為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程：A=5.1337ρ-0.0430，R^2=0.9994，線性范圍是0.013～0.098 mg/mL。

2.2.6?精密度試驗?精密吸取粗多糖樣液1 mL，按“2.2.4”項下方法操作，在620 nm處測定其吸收值，重復測定6次，相對標準偏差RSD為3.66%，結果見表5。

2.2.7?穩定性試驗?精密稱取三七粗多糖0.3 g，按“2.2.2”、“2.2.4”項下方法操作，分別在10、20、30、40、50、60 min測定吸光度。相對標準偏差RSD為0.073%，表明加入蒽酮、硫酸的供試溶液在60 min內穩定，結果見表6。

2.2.8?回收率試驗?精密量取0.3 mL供試液三份，分別加入0.1、0.2、0.3 mL標準溶液，加水補足1 mL，按“2.2.4”項下方法操作，在620 nm處測定其吸光度，按公式計算加樣回收率，平均回收率為97.6%，RSD=0.95%，結果見表7。

2.2.9?三七粗多糖的含量?測定精密吸取1 mL“2.2.2”項下樣液于具塞試管中。按“2.2.4” 項下方法操作，在波長為620 nm處測定吸光度，根據吸光度從回歸方程求出三七粗多糖的含量是29.77%，RSD=1.17%，結果見表8。

3?討論

實驗開展了對三七廢棄物的綜合利用研究，從廢棄物中提取三七多糖。三七粗多糖含量的測定方法一般有比色法、3-5-二硝基水楊酸比色法以及傅里葉變換紅外光譜（FTIR）結合支持向量機回歸 硫酸-苯酚法、蒽酮-硫酸（SVR）法[6]，課題組用兩種便于生產企業常用的硫酸-苯酚法、蒽酮-硫酸法測定了三七粗多糖含量;比較了苯酚硫酸法和蒽酮硫酸法在測定三七多糖含量中的優劣。對于三七粗多糖，比較表1和表5可知：從穩定性來看，苯酚硫酸法和蒽酮硫酸法均適合于三七粗多糖含量的測定。比較表2和表6可知：從精密度的角度來看，苯酚硫酸法較蒽酮硫酸法可靠。比較表3和表7可知：從加標回收實驗結果來看，使用苯酚硫酸法測定時，回收率更高。因此，苯酚硫酸法較之蒽酮硫酸法，操作更簡便、安全、快捷。因此，選用苯酚硫酸法測定三七粗多糖含量較優。

三七多糖單糖組分結構復雜，文獻一級表征結構表明三七多糖主要由葡萄糖、乳糖、阿拉伯糖組成[7]，實際實驗分析和生產檢測中發現，對三七粗多糖進行微孔濾膜截留得到不同段次三七多糖，分子量大的3～5萬，分子量小的幾千[8-9]，經過檢測發現，分子量小的多糖以葡萄糖為對照，測定則多糖含量非常低，薄層鑒別發現、乳糖，阿拉伯糖點非常濃。同樣的對粗多糖進行脫蛋白、脫淀粉、脫氨基酸、脫鹽處理后含量也僅僅能達到70%～80%左右，由此可知由于三七多糖單糖組分的復雜性，選擇單一葡萄糖為對照，采用廣譜的紫外分關光度法測定，仍然具有一定的極限性，還有很多工作要做。

三七多糖含量測定方法研究有利于三七多糖質量標準的完善，對進一步深入研究我國特有三七資源、提高其附加值、增加種植戶收入做出積極貢獻，具有較好的經濟和社會效益，也可給人們提供新的保健品，為人類健康做出貢獻。

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（收稿日期：2020-04-21）