不同pH條件下五倍子中β-PGG水解產物分析及其含量研究

張艷嬌 楊玲 向潤清 黃寬 方山丹 范源 朱培芳

摘要：目的?研究并分析β-PGG、3GG、GA、PA等在不同pH磷酸鹽緩沖液中的含量變化及β-PGG水解產物分析情況。方法?采用經典恒溫法考察β-PGG、GA、PA在不同pH緩沖液（pH=2、3、4、5、6、7、8）中的水解情況，用RP-HPLC法在同一色譜條件下對β-PGG水解產物進行分析及含量測定。結果?在同一色譜條件下發現β-PGG分解為GA和少量3GG之外，同時考察了GA在不同緩沖溶液中的產物分析，發現GA可生成少量3GG及PGG，未見PA分解。結論?β-PGG及GA、PA在不同pH條件下的含量變化反映了不同酸堿度對β-PGG水解反應的影響;本實驗也發現β-PGG可分解為GA，3GG;GA在一定的條件下會合成3GG及β-PGG。目前文獻多報道β-PGG的合成，其在不同PH條件下分解的產物及產物含量變化的研究報道較少，本研究有助于了解β-PGG的化學穩定性及其分解產物的相關性，可為進一步研究β-PGG的理化特性及鞣質類中藥的養護、儲存、加工及臨床應用提供一定參考。

關鍵詞：β-PGG;1，3，6-Tri-O-galloylglucose;沒食子酸;焦性沒食子酸;pH緩沖液;水解反應

中圖分類號：R285?文獻標志碼：A?文章編號：1007-2349（2020）08-0054-05

【Abstract】Objective： To study and analyze the content changes and β-PGG hydrolysates of β-PGG， 3GG， GA and PA in different pH phosphate buffers.?Methods： The classic constant temperature method was used to investigate the hydrolysis of β-PGG， GA， and PA in different pH buffers （pH=2， 3， 4， 5， 6， 7， and 8）.?The RP-HPLC method was used under the same chromatographic conditions.?Results： Under the same chromatographic conditions， it was found that β-PGG was decomposed into GA and a small amount of 3GG.?At the same time， the product analysis of GA in different buffer solutions was investigated and GA was found to generate a small amount of 3GG and PGG， and no PA decomposition was seen.?Conclusion： The content changes of β-PGG， GA and PA under different pH conditions reflect the influence of different pH on the hydrolysis reaction of β-PGG.?This experiment also find that β-PGG can be decomposed into GA and 3GG and GA under certain conditions can synthesize 3GG and β-PGG.?At present， the literature mostly reports the synthesis of β-PGG， and few research reports on its decomposition products and product content changes under different pH conditions.?This study helps to understand the chemical stability of β-PGG and the correlation of its decomposition products and can provide a reference for further research on the physical and chemical properties of β-PGG and the maintenance， storage， processing and clinical application of tannin Chinese medicine.

【Key words】β-PGG， 1，3，6-Tri-O-galloylglucose， gallic acid， pyrogallic acid， pH buffer， hydrolysis reaction

1，2，3，4，6-五-O-沒食子酰基葡萄糖（1，2，3，4，6-penta-O-galloyl-β-D-glucose，β-PGG）屬天然水解類鞣質，是單寧類中最有效的抗氧化劑之一，來自于多種藥用植物，如五倍子、芍藥、余甘子等。β-PGG具有廣泛的生物活性和藥理活性，如抗炎癥、抗氧化、抗糖尿病等作用[1-4]，其能通過誘導細胞凋亡[5]、防止突變、轉移和新生血管生成[6-8]。β-PGG在治療各種癌癥方面具有良好效應，包括肝癌[9-10]、乳腺癌[11]、結腸癌[12-13]、腎癌[14]和前列腺癌[15-16]等。β-PGG對癌細胞的選擇性殺傷作用極其重要，它抗腫瘤和抗糖尿病等作用需要進一步探索以充分發揮其潛力，故研究β-PGG及其水解產物的化學特性及藥效學特性有較為重要的意義。

β-PGG是5個沒食子酸與1個葡萄糖酯化反應的產物，在該反應過程中沒食子酸（gallic acid，GA）與葡萄糖上的羥基結合，逐步生成二沒食子酰葡萄糖、三沒食子酰葡萄糖、四沒食子酰葡萄糖和五沒食子酰葡萄糖，其在pH值為5～6范圍內較穩定，在pH值為7.0條件下分解[17]。β-PGG在酸、堿條件下水解過程與上述酯化過程相反，分解為1，3，6-Tri-O-galloylglucose（3GG），最終水解為GA。GA在五倍子、蘇木、金縷梅、茶葉、橡樹樹皮和其他植物中大量存在，具有清除自由基的能力，是一種優良的抗氧化劑，具有廣譜的治療作用，包括抗腫瘤[18-19]、抗炎[20-21]、抗肥胖[22]、抗菌和抗糖尿病[23-27]等。目前其主要藥用用途包括鎮痛劑、收斂劑和抗菌藥物，研究發現它和它的酯類衍生物可作為一種有價值的抗癌藥物[28-29]。焦性沒食子酸（Pyrogallol Acid，PA），又稱鄰苯三酚、焦醅酚、焦棓酸，是存在于許多植物果實中的天然多酚類化合物，其多應用于農藥、合成醫藥、顯影劑以及化學分析試劑等，是許多藥物的有效成分和重要的抗氧化劑;GA經過化學法脫羧反應后得PA，也可利用生物法在沒食子酸脫羧酶的作用下發生脫羧反應生成PA[30-31]。化學結構式見圖1。

本實驗將根據多酚類化合物的特性考察在同一HPLC色譜條件不同pH對β-PGG、GA分解和或合成產物及產物含量分析。

1?材料

1.1?試劑?甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、甲醇（分析純）、磷酸（分析純）、磷酸氫二鈉（分析純）等購自云南丹赤貿易有限公司;純凈水購自杭州娃哈哈集團有限公司。1，2，3，4，6-五-O-沒食子酰葡萄糖（委托成都普瑞法科技開發公司從五倍子中提取，共2.5g，含量≥98%）成都普瑞法科技開發有限公司;1，3，6-Tri-O-galloylglucose（批號：CFN95043，含量≥98%），武漢天植生物技術有限公司;沒食子酸對照品（批號：16081904，含量≥98%），四川省維克奇生物科技有限公司;焦性沒食子酸對照品（批號：16052801，含量≥98%），上海源葉生物科技有限公司。

1.2?儀器?Agilent 1200系列高效液相色譜儀（VWD 紫外檢測器），美國安捷倫公司;FA1004N型1/1萬電子分析天平，上海菁海儀器有限公司;YL-080ST型超聲清洗機，深圳市語路清洗設備有限公司;酸度計，梅特勒-托利多儀器有限公司;數顯恒溫水浴鍋，北京永光明醫療儀器廠。

2?方法

2.1.1?磷酸鹽緩沖液的配制?A液：取磷酸10mL，加純化水至100mL，搖勻。B液：稱取磷酸氫二鈉7.2g，加純化水使溶解成100mL。分別取不同體積的A，B液用酸度計調pH值到2、3、4、5、6、7、8，分別置于50mL容量瓶中，備用。

2.1.2?對照品溶液的制備?分別精密稱取對照品β-PGG 2.3mg，3GG 2.2mg，GA 3.1mg，PA 2.6mg置于10mL容量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度，搖勻，備用。

2.1.3?供試品溶液的制備?考察β-PGG、GA在pH為3、4、5、6、7、8時的緩沖液分解產物。稱取β-PGG、GA對照品各2.6mg分別于12個10mL容量瓶中，超聲使其溶解之后，置于60℃～65℃水浴鍋上保存12h后用微孔濾膜（0.45μm）濾過，即得供試品溶液。

2.1.4?色譜條件?色譜柱ZORBAX SB-C18柱（4.6×250mm，5μm）;柱溫25℃;檢測波長280nm;流速1mL/min;進樣量10μL;乙腈和0.1%磷酸梯度洗脫，洗脫程序見表1。

2.1.5?測定不同pH條件下β-PGG、GA分解和或合成產物的含量變化?使用色譜柱ZORBAX SB-C18柱（4.6×250mm，5μm），按表4色譜條件，取2.2.1對照品分別2、4、6、8、10、12、14、16μL不同體積進樣，以其峰面積（Y）對其標準品的質量（X）測得β-PGG、3GG、GA、PA的線性范圍如表5所示，其精密度分別為1.14、1.14、1.54、1.53%;同時測定2.2.2供試品溶液的含量變化如表6所示。

實驗結果發現，同一色譜條件不同pH條件下，β-PGG可分解為3GG、GA，未見PA分解;GA也可分解，同時觀察到GA在一定的pH情況下還會合成3GG、β-PGG，未見PA分解，見圖3。

3?結果與討論

3.1?實驗結果?根據實驗結果可知β-PGG在酸性條件下較為穩定，隨著pH增大，其分解較快，結合第二部分實驗，pH越大，分解生成3GG、GA的含量也增加;對于GA，酸性條件時，含量變化不大，至但隨著pH增大，其降解生成3GG、β-PGG的含量隨之增大，但pH為8時，未見任何化合物的生成，這可能與酸堿度對其影響較大，故迅速降解有關。

3.2?存在問題及展望?本次實驗應用同一色譜條件將β-PGG、3GG、GA、PA分解出來，但是峰形還需進一步改善;其次，本實驗過程發現GA在隨著pH增大時，其顏色逐漸變為綠色、深綠色，在60℃加熱12h后，其顏色未發生較大變化，沒有考察加熱對其分解的影響，之后還應改進實驗設計方案。

β-PGG、GA存在于多種鞣質類中藥，研究不同酸堿度對其影響有助于了解β-PGG、GA的化學穩定性、提高其生物利用度，為進一步研究β-PGG的理化性質，將其更好地用于臨床及鞣質類中藥的養護、儲存、加工及臨床應用提供一定參考依據。

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（收稿日期：2020-06-26）