多黏類芽孢桿菌微生物絮凝劑的制備及其性能試驗研究

李夢茜，龍潔云，蔡承儒，張振旺

(1.河池學院 化學與生物工程學院，廣西 宜州 546300；2.湖北科技學院 醫藥研究院，湖北 咸寧 437100)

無機絮凝劑、有機高分子絮凝劑和天然絮凝劑等都在工業領域有廣泛應用。聚丙烯酰胺等有機高分子絮凝劑價格低廉且絮凝效果較好，但其中有些不容易降解，有些降解后的單體可能對環境有不利影響。微生物絮凝劑具有生物降解性，且降解中間體對環境無害[1]。蛋白質絮凝劑[2-3]、多糖絮凝劑[4-12]、糖蛋白絮凝劑[13-20]，以及由枯草芽孢桿菌生產的聚谷氨酸[21-25]和黃單胞菌生產的黃原膠[26-27]等均具有絮凝活性，可以作為無害生物聚合物絮凝劑。試驗分離出一株芽孢桿菌L2019-1，其可以產生生物高分子絮凝劑，研究了該微生物絮凝劑的絮凝活性，確定了其化學組成。

1 試驗部分

1.1 芽孢桿菌L2019-1的篩選

采用瓊脂平板培養法，以高嶺土懸浮液為絮凝對象，以LB為基礎培養基，從宜州污水處理廠污泥樣品中分離出一株芽孢桿菌L2019-1。觀察菌落形態、顯微細胞形態，分析菌株的生理生化特征，測定16S rRNA序列，確定芽孢桿菌L2019-1的種屬類別。

1.2 微生物絮凝劑的制備

在30 ℃、120 r/min攪拌條件下，將芽孢桿菌L2019-1置于含1%葡萄糖、1%蛋白胨、0.5%酵母提取物的基礎培養基(pH=7.0)中，于搖床中振蕩培養48 h。培養后，用NaOH溶液將發酵液pH提高到11.5，攪拌20 min，使細胞表面絮凝劑溶出；然后在12 000 r/min條件下將黏稠發酵液離心15 min，之后在上清液中加入2倍體積的冷乙醇沉淀絮凝劑，于8 000 r/min條件下離心10 min后收集絮凝劑并溶于蒸餾水中。經過3次乙醇沉淀后在蒸餾水中透析和凍干，得到微生物絮凝劑粗品。絮凝劑粗品中含有蛋白質，采用Sevag法去除后，得到較純的微生物絮凝劑。

1.3 絮凝活性測定

用高嶺土懸浮液對微生物絮凝劑純品測定絮凝活性。將0.2 mL微生物絮凝劑溶液、9.4 mL質量濃度4 g/L高嶺土懸浮液和0.4 mL的CaCl2溶液加入到離心管中，混合后用渦流混合器攪拌混合并靜置10 min。從離心管上層取0.2 mL上清液，加入到96孔板中，在550 nm(B)波長處測定吸光度。用同樣方式對不含絮凝劑的溶液進行對照試驗，測定550 nm(A)波長處的吸光度。絮凝活性計算公式為

式中：μ—絮凝率，%；A—對照上清液吸光度；B—加入絮凝劑后上清液吸光度。

用同樣方法考察絮凝劑在活性炭、纖維素和酵母懸浮液中(550 nm處的吸光度調為1.4)的絮凝活性。酵母懸浮液用面包酵母制備。

1.4 微生物絮凝劑的成分分析

以葡萄糖為標準，采用苯酚-硫酸法測定總糖含量。以半乳糖醛酸為標準，采用硫酸咔唑法測定糖醛酸含量。以氨基葡萄糖為標準，采用Morgan-Elson法測定氨基糖含量。以牛血清白蛋白為標準，采用考馬斯亮藍法測定蛋白質。

采用高效液相色譜法測定絮凝劑純品的單糖組成：凍干樣品2 mg在濃度3 mol/L鹽酸溶液中,于100 ℃下水解4 h，氮吹儀吹干。水解后干燥得到的單糖樣品中加入濃度為0.5 mol/L的1-苯 基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)甲醇溶液和濃度為0.3 mol/L的NaOH溶液各0.5 mL，混合充分后，于70 ℃水浴中反應30 min。之后冷卻至室溫，加入0.3 mol/L鹽酸溶液0.5 mL，混合充分后再加入0.5 mL氯仿，劇烈振蕩萃取。離心分相后用0.22 μm濾膜過濾后進行分析。絮凝劑分子質量采用凝膠層析法測定，用日本島津色譜柱，流速為1.0 mL/min，以濃度為0.1 mol/L的NaCl溶液為溶劑，以藍色葡聚糖分子質量為標準。

2 試驗結果與討論

2.1 菌株篩選與鑒定

經固體平板劃線分離，從污泥中分離出的菌株為芽孢桿菌L2019-1。菌液對高嶺土懸濁液的絮凝率為72%，且絮凝性穩定。

2.2 L2019-1菌株的形態與理化特征

L2019-1菌在LB固體培養基上呈乳白色圓形半透明菌落，表面光滑，呈橢圓桿狀，有黏性(圖1)。采用VITEK全自動微生物檢測系統分析其理化性質，結果見表1。可以看出，L2019-1菌株形態和理化特征與芽孢桿菌屬較為一致。

a—菌落形態；b—顯微鏡下的細胞形態(放大1 000倍)。圖1 菌株L2019-1的形態

表1 菌株L2019-1的生化特征

2.3 16S rRNA序列分析

對L2019-1菌株提取總DNA后進行測序，16S rRNA測序結果采用BLAST程序與NCBI數據庫中信息進行同源性比對，構建出系統進化樹，結果如圖2所示。依據比對結果，L2019-1菌株屬于多黏類芽孢桿菌。

圖2 L2019-1菌株的16S rRNA序列的系統進化樹

2.4 絮凝劑的絮凝性能

2.4.1 在高嶺土懸浮液中的絮凝性能

在高嶺土懸浮液中，此微生物絮凝劑的絮凝活性受其濃度、助凝劑陽離子、反應溫度及懸浮液pH的影響。試驗條件下，絮凝劑最佳絮凝活性時的質量濃度為30 mg/L左右(如圖3所示)。

圖3 絮凝劑濃度對絮凝率的影響

高嶺土懸浮液中加入陽離子對微生物絮凝劑的絮凝活性有一定影響。以AlCl3·6H2O、FeCl3·6H2O、CaCl2·2H2O、MgCl2·6H2O、NaCl和KCl為陽離子源，圖4為微生物絮凝劑在含1 mmol/L陽離子的高嶺土懸浮液中的絮凝活性。可以看出：A13+、Fe3+、Ca2+對絮凝劑的絮凝活性有明顯刺激作用，能顯著提高絮凝活性。

圖4 陽離子種類對絮凝劑絮凝率的影響

在含有A13+、Fe3+、Ca2+的高嶺土懸浮液中，陽離子質量濃度對絮凝劑絮凝率的影響試驗結果如圖5所示。

圖5 陽離子濃度對絮凝劑絮凝率的影響

由圖5看出：絮凝劑的絮凝活性隨Ca2+濃度升高而提高；Fe3+、Al3+濃度分別為0.8、0.2 mmol/L時，絮凝劑的絮凝率最佳。由于A13+在低濃度下效果明顯，因此，推斷Al3+是增強絮凝劑絮凝活性的合適陽離子。推測A13+、Fe3+、Ca2+通過中和穩定碳的剩余負電荷而促進絮凝作用。懸浮液中加入陽離子是誘導微生物絮凝劑有效絮凝活性的充分條件。試驗結果與紅潮紅球菌和杯狀假堿菌所制備微生物絮凝劑需添加Ca2+和Al3+才具有較高絮凝活性的要求相一致[28-29]。

體系pH、溫度對絮凝劑絮凝率的影響試驗結果分別如圖6、7所示。

圖6 體系pH對絮凝劑絮凝率的影響

圖7 溫度對絮凝劑絮凝率的影響

由圖6、7看出：體系pH=6.0條件下，含0.2 mmol/L Al3+的高嶺土懸浮液中，絮凝活性最高；最佳絮凝溫度為20～30 ℃。

2.4.2 在活性炭懸浮液中的絮凝活性

活性炭懸浮液中絮凝劑質量濃度對絮凝率的影響試驗結果如圖8所示。可以看出，該絮凝劑對活性炭懸浮液的最佳絮凝質量濃度為20～30 mg/L。可以認為，該絮凝劑適用于含碳無機廢水，如煤泥水的固液分離和凈化。

圖8 活性炭懸浮液中絮凝劑質量濃度對絮凝率的影響

2.4.3 在纖維素、酵母懸浮液中的絮凝活性

酵母和纖維素懸浮液中絮凝劑質量濃度對絮凝率的影響試驗結果如圖9所示。可以看出，在纖維素、酵母等有機懸浮液中，絮凝劑的絮凝活性很好：在纖維素懸浮液中，最佳質量濃度為30 mg/L；在酵母懸浮液中，最佳質量濃度為40 mg/L。

圖9 酵母和纖維素懸浮液中絮凝劑質量濃度對絮凝率的影響

2.5 絮凝劑的成分

依據文獻[3]，微生物絮凝劑的主要化學成分為糖類、多肽、蛋白質、核酸和脂類物質。

絮凝劑粗品由多糖和少量蛋白質組成：根據考馬斯亮藍法，粗品中約含25%蛋白質；苯酚-硫酸法測得其總糖質量分數為74%。

絮凝劑純品為酸性多糖物質，由醛酸和中性糖組成。根據Morgan-Elson法，其不含氨基糖；依據硫酸咔唑法，其酸性多糖中醛酸質量分數約為18%。

絮凝劑純品水解后以高效液相色譜法分析單糖種類及質量分數，結果見表2。可以看出，其含有9種單糖，以葡萄糖、半乳糖和半乳糖醛酸為主。其凝膠色譜顯示只有單峰且分子摩爾質量約為2.4×106g/mol。

表2 單糖種類及質量分數

3 結論

用分離得到的多黏類芽孢桿菌L2019-1可制備高分子絮凝劑。此絮凝劑的絮凝活性受體系中陽離子、體系pH、溫度等因素影響。高嶺土懸浮液中，Ga2+、Fe3+、Al3+的存在可促進絮凝，最佳pH=6.0，適宜溫度30 ℃。該絮凝劑在無機和有機懸浮液中都表現出良好的絮凝活性，所以，有必要繼續優化芽孢桿菌L2019-1的培養條件，以用廉價方式獲得較高絮凝劑產量。