硼替佐米調節(jié)NF-κB 途徑對IL-1β 誘導的ATDC5細胞炎癥性損傷的影響研究

莫湘濤,張依山,李勇軍,肖永杰

(1.河南省洛陽正骨醫(yī)院/ 河南省骨科醫(yī)院髖部損傷科, 鄭州 450046;2.河南省洛陽正骨醫(yī)院/河南省骨科醫(yī)院風濕科, 鄭州 450046;3.河南省洛陽正骨醫(yī)院/ 河南省骨科醫(yī)院檢驗科, 鄭州 450046;4.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九八八醫(yī)院骨關節(jié)科, 鄭州 475300)

骨關節(jié)炎屬老年人常見疾病,會出現(xiàn)局部滑膜炎癥反應,誘發(fā)關節(jié)處疼痛,影響患者生活質量[1]。緩解關節(jié)炎、減少疼痛對于疾病意義重大。 硼替佐米(bortezomib,Bor) 在細胞增殖、凋亡,減少炎癥產生等免疫調節(jié)通路中發(fā)揮重要作用[2],可調節(jié)結腸炎癥反應預防小鼠硫酸葡聚糖鈉引起的潰瘍性結腸炎從而緩解疾病[3]。 類風濕關節(jié)炎實驗中,抑制核因子κB( nuclear factor κB,NF-κB) 可減緩疼痛、炎癥和骨骼損傷[4]。 Bor 可能通過抑制NF-κB 途徑緩解骨關節(jié)炎從而影響疾病。 本研究通過白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β) 誘導ATDC5 細胞造成炎癥損傷,探究Bor 對ATDC5 炎癥損傷的影響,并初步探討其機制。

1 材料和方法

1.1 實驗細胞

未分化的小鼠軟骨細胞株ATDC5 購自美國Sigma 公司,貨號:99072806。

1.2 主要試劑與儀器

Bor 購自西安楊森制藥公司, 批準文號:H20170321;人重組IL-1β 購自美國PeproTech 公司,貨號:AF-211-11B-2;CCK-8 試劑盒、Annexin VFITC 細胞凋亡檢測試劑盒均購自碧云天生物科技有限公司,貨號分別為:C0037、C1062S;IL-1β ELISA試劑盒、一抗p-NF-κB、NF-κB(兔抗鼠)、B 細胞淋巴瘤/ 白血病-2 原癌基因(B cell lymphoma / lewkmia- 2, BcL-2) ( 兔抗鼠)、 BcL-2 相關X 蛋白( BcL-2 associated X protein, BAX) ( 兔抗鼠) 均購自美國abcam 公 司, 貨 號 分 別 為: ab9722、 ab16502、ab220803、ab32124、ab32503。 CO2培養(yǎng)箱購自山東博科科學儀器有限公司,型號:GSPX-50;酶標儀購自賽默飛世爾科技有限公司,型號:Varioskan LUX;流式細胞儀購自美國貝克曼庫爾特公司, 型號:DxFLEX;蛋白凝膠成像儀購自美國BIO-RAD 公司,型號:GelDoc 2000。

1.3 實驗方法

1.3.1 ATDC5 細胞的處理

ATDC5 細胞培養(yǎng):實驗前DMEM/ F12 培養(yǎng)基添加10%胎牛血清、100 萬U/ mL 青鏈霉素混勻制成DMEM/ F12 完全培養(yǎng)基置于4℃冰箱中待用。ATDC5 細胞加入DMEM/ F12 完全培養(yǎng)基于37℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細胞密度培養(yǎng)至70% ～80%時進行下一步實驗。 ATDC5 細胞處理:DMEM/ F12完全培養(yǎng)基稀釋Bor 制成0.25 mmol/ L Bor 待用;DMEM/ F12 完全培養(yǎng)基溶解IL-1β 制成100 mg / mL IL-1β 待用。 分別用0、5、15、25、35、45、55 nmol/ L Bor 處理ATDC5 細胞48 h,篩選無細胞毒性Bor 濃度范 圍, 分 別 用0、 1.0、 5.0、 12.5、 25.0 nmol/ L Bor[5]DMEM/ F12 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞1 h,添加10 μg / mL IL-1β[6]置于96 孔板和6 孔板共培養(yǎng);空白細胞(即0 nmol/ L Bor)為對照組。

1.3.2 CCK-8 檢測細胞增殖情況

96 孔板中細胞Bor 和IL-1β 共培養(yǎng)48 h,添加CCK-8 試劑,培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h,酶標儀檢測450 nm 處各孔細胞光密度(optic density,OD),設置6 個 重 復。 細 胞 存 活 率= OD450實驗組/ OD450對照組×100%。

1.3.3 流式細胞術檢測細胞凋亡情況

6 孔板中細胞培養(yǎng)48 h,每孔收集1×106個細胞,按照Annexin V-FITC 試劑盒說明書,添加195 μL Annexin V-FITC 結合液、5 μL Annexin V-FITC 后輕輕混勻,然后加入10 μL 碘化丙啶染色液輕輕混勻。 流式細胞儀1 h 內檢測細胞凋亡率。

1.3.4 ELISA 檢測上清液中炎癥因子IL-1β 水平

6 孔板中細胞培養(yǎng)48 h 后收集細胞培養(yǎng)液,3000 r/ min 離心5 min 收集上清,分裝置于4℃冰箱待用。 嚴格按照IL-1β ELISA 試劑盒說明書操作,檢測上清液中IL-1β 水平。

1.3.5 蛋白免疫印跡檢測細胞中NF-κB、 BAX、BcL-2 蛋白水平

6 孔板中細胞培養(yǎng)48 h 后,吸去培養(yǎng)液,每孔添加200 μL TRIzol,冰上裂解20 min,收集細胞混合液,13400 r/ min 離心15 min 收集上清即為細胞總蛋白,凝膠電泳分離蛋白質后轉膜;5%脫脂奶粉室溫封閉2 h;對應加入一抗NF-κB p65、BAX、BcL-2、GADPH,4℃孵育過夜;加入對應的二抗,室溫孵育1 h;DAB 顯色試劑盒避光顯色;蛋白凝膠成像儀拍照和定量分析。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計學軟件SPSS 24.0 進行數(shù)據(jù)分析,計量資料以平均數(shù)±標準差()描述,多組比較用單因素方差分析,進一步兩兩比較采用SNK-q法。當P<0.05 時,差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 細胞毒性實驗

CCK8 結果顯示,0、5、15、25 Bor 組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。 與0 nmol/ L Bor 組相比,35、45、55 Bor 組細胞存活率降低(P<0.05)。 詳見圖1。

2.2 Bor 對細胞增殖的影響

與0 nmol/ L Bor 組相比,IL-1β 組細胞存活率降低(P< 0.05)。 與IL-1β 組相比, 1.0、 5.0、 12.5、25.0 nmol/ L Bor + IL-1β 組細胞存活率升高(P<0.05)。 見圖2。

圖1 各濃度Bor 處理細胞存活率情況Note.Compared with 0 nmol/ L Bor group, aP<0.05.Figure 1 Cell survival rate of Bor in different concentrations

2.3 Bor 對細胞凋亡的影響

與0 nmol/ L Bor 組相比,IL-1β 組細胞凋亡率升高(P< 0.05)。 與IL-1β 組相比, 1.0、 5.0、 12.5、25.0 nmol/ L Bor + IL-1β 組細胞凋亡率降低(P<0.05)。 見圖3A、3B。

2.4 Bor 對上清液中IL-1β 的影響

與0 nmol/ L Bor 組相比,IL-1β 組上清液中IL-1β 水平升高(P< 0.05)。 與IL-1β 組相比,12.5、25.0 nmol/ L Bor+IL-1β 組上清液中IL-1β 水平降低(P<0.05)。 見圖4。

2.5 Bor 對細胞中NF-κB 蛋白的影響

與0 nmol/ L Bor 組相比,IL-1β 組細胞中p-NFκB / NF-κB 水平升高(P<0.05)。 與IL-1β 組相比,1.0、5.0、12.5、25.0 nmol/ L Bor+IL-1β 組細胞中p-NF-κB / NF-κB 蛋 白 水 平 降 低(P< 0.05 )。 見 圖5A、5B。

2.6 Bor 對細胞中BcL-2、BAX 蛋白的影響

與0 nmol/ L Bor 組相比,IL-1β 組細胞中BcL-2蛋白水平降低(P<0.05);BAX 蛋白水平升高(P<0.05)。 與IL-1β 組相比,12.5、25.0 nmol/ L Bor +IL-1β 組細胞中BcL-2 蛋白水平升高(P< 0.05);25.0 nmol/ L Bor+IL-1β 組細胞中BAX 蛋白水平降低(P<0.05)。 見圖6A、6B。

3 討論

骨關節(jié)炎患者會出現(xiàn)關節(jié)軟骨進行性退變、滑膜炎癥、疼痛,受多因素影響,患者軟骨組織處細胞增殖、凋亡異常,影響患者健康[7]。 目前治療骨關節(jié)炎主要以改善關節(jié)功能、減輕炎癥從而緩解疼痛為主。 其中Bor 作為目前唯一應用于臨床的蛋白酶體抑制劑,在多發(fā)性骨髓瘤中可影響腫瘤凋亡從而影響腫瘤生長[8];在炎癥性腸病小鼠中抑制NF-κB活性、抑制炎癥因子TNF-α 水平從而起到治療腸炎性腸病目的[9]。 Bor 能夠改善骨損傷從而治療早期骨關節(jié)炎[10]。

圖2 Bor 聯(lián)合IL-1β 處理細胞48 h 各組細胞存活率比較(± s, n= 6)Note.Compared with 0 nmol/ L Bor group, aP< 0.05.Compared with IL-1β group, bP<0.05.Figure 2 Comparison of cell survival rate in 48 h groups treated with bor and IL-1β

圖3 Bor 聯(lián)合IL-1β 處理各組細胞凋亡率比較(± s, n= 6)Note.A, Flow cytogram.B, Corresponding histogram.Compared with 0 nmol/ L Bor group, aP < 0.05.Compared with IL-1β group, bP < 0.05.Figure 3 Comparison of cell apoptosis rate of Bor and IL-1β treatment groups

圖4 Bor 聯(lián)合IL-1β 處理各組細胞上清液中IL-1β 水平比較(± s, n= 6)Note.Compared with 0 nmol/ L Bor group, aP < 0.05.Compared with IL-1β group, bP < 0.05.Figure 4 Comparison of IL-1 β levels in supernatant of cells treated with Bor and IL-1β

IL-1β 屬典型的致炎因子,可促進炎癥反應,在炎癥疾病中高表達可誘發(fā)炎癥機制,可反映細胞損傷炎癥程度[11]。 正常情況下關節(jié)滑液中存在微量IL-1β;骨關節(jié)炎軟骨組織、滑液中能檢測到較高含量IL-1β,IL-1β 參與炎癥反應和免疫調節(jié)[12],另外研究發(fā)現(xiàn)IL-1β 可促進新生大鼠骨關節(jié)炎中軟骨細胞凋亡[13]。 BcL-2 是一種參與細胞凋亡基因,細胞正常狀態(tài)下可阻止線粒體中細胞色素C 釋放入胞漿之中,從而阻止細胞凋亡[14];BAX 是BcL-2 家族中研究最廣泛的促凋亡基因,與BcL-2 作用相反,可促進線粒體中細胞色素C 的釋放從而促進凋亡,而細胞色素C 從線粒體釋放到胞漿是細胞凋亡中關鍵一步[15]。 在骨關節(jié)炎患者中BcL-2 水平降低、BAX 水平升高從而促進細胞凋亡[16]。 本研究發(fā)現(xiàn),IL-1β 誘導ATDC5 細胞后,與0 nmol/ L Bor 組相比,IL-1β 組細胞存活率、細胞中BcL-2 蛋白水平降低,凋亡率、細胞中BAX 蛋白水平升高。 提示IL-1β可抑制ATDC5 細胞存活、促進其凋亡,誘導細胞炎癥損傷,造成關節(jié)炎。 與IL-1β 組相比,(1.0、5.0、12.5、25.0)nmol/ L Bor+IL-1β 組細胞存活率、細胞中BcL-2 蛋白水平升高,凋亡率、細胞中BcL-2 蛋白水平降低。 提示Bor 可抑制ATDC5 細胞凋亡,促進BcL-2 蛋白水平表達、抑制BAX 蛋白水平表達,增加細胞存活率,且隨著劑量增加,該作用逐漸增強,可能Bor 在細胞炎癥中發(fā)揮抗凋亡作用從而緩解疾病。

圖5 Bor 聯(lián)合IL-1β 處理各組細胞中NF-κB 蛋白水平比較(± s, n= 6)Note.A, Protein band diagram.B, Corresponding histogram.Compared with 0 nmol/ L Bor group, aP < 0.05.Compared with IL-1β group, bP < 0.05.Figure 5 Comparison of NF-κB protein levels in cells treated with Bor and IL-1β

圖6 Bor 聯(lián)合IL-1β 處理各組細胞中BcL-2、BAX 蛋白水平比較(± s, n = 6 )Note.A, Protein band diagram.B, Corresponding histogram.Compared with 0 nmol/ L Bor group, aP < 0.05.Compared with IL-1β group, bP < 0.05.Figure 6 Comparison of BcL-2 and Bax protein levels in cells treated with Bor and IL-1β

NF-κB 分子是廣泛表達的轉錄因子家族,參與應激反應、免疫、細胞增殖、炎性疾病和細胞凋亡等過程,是炎癥細胞因子誘導的軟骨細胞中分解代謝作用的中樞調節(jié)劑[17]。 當細胞受炎癥因子刺激時可誘導IL-6、IL-8、環(huán)氧化酶2 等表達,從而促進細胞損傷、促進炎癥反應[18]。 IL-1β 激活表面的細胞因子受體導致NF-κB 從細胞質轉移向細胞核,從而促進炎癥介質表達,可通過抑制NF-κB 水平從而緩解IL-1β 引起的軟骨細胞炎癥反應[19]。 而細胞凋亡與NF-κB 從細胞質向細胞核的轉運密切相關[20]。 本研究發(fā)現(xiàn),與0 nmol/ L Bor 組相比,IL-1β組細胞中NF-κB 蛋白水平升高,提示IL-1β 可促進NF-κB 水平表達,可能是IL-1β 促進NF-κB 從細胞質轉移向細胞核轉移誘導炎癥介質表達促發(fā)炎癥反應。 與IL-1β 組 相 比, ( 1.0、 5.0、 12.5、 25.0)nmol/ L Bor+IL-1β 組細胞中NF-κB 蛋白水平降低,且隨著Bor 劑量升高,細胞中NF-κB 水平逐漸降低,提示Bor 可直接作用緩解IL-1β 導致的NF-κB 水平升高現(xiàn)象,且隨著劑量升高,該作用效果明顯,從而降低炎癥因子水平表達,抑制細胞凋亡,實現(xiàn)對IL-1β 誘導的細胞炎癥損傷的保護作用。

綜上所述,Bor 對IL-1β 誘導的ATDC5 細胞可抑制細胞凋亡及炎癥因子表達,實現(xiàn)對ATDC5 細胞的保護,可能是通過抑制NF-κB 途徑實現(xiàn)的。