去甲氧基姜黃素通過PI3K-Akt-mTOR信號通路調控細胞自噬對心肌缺血再灌注損傷大鼠的保護作用研究

崔健昆，耿乃志，孟凡吉，施麗春，田耕,楊桂青

(1．黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040； 2.哈爾濱醫科大學，黑龍江 哈爾濱 150081;3.煙臺中醫醫院，山東 煙臺 264000)

心肌缺血再灌注損傷(Myocardial ischemic reperfusion in jury，MIRI) 指冠狀動脈短暫阻塞后再通所造成心肌組織結構損傷加重的病理過程。其發病機制十分復雜，氧化應激、中性粒細胞浸潤、鈣超載和細胞凋亡等機制均與MIRI關系密切。細胞自噬作為一種內源性保護機制，在 MIRI的發生和進展過程中發揮著重要作用，成為新的治療靶點[1-2]。mTOR屬于PI3K蛋白激酶類家族中成員，是許多與自噬相關的信號通路交匯節點，而且與 MIRI有著密切的聯系[3]，其中PI3K-Akt-mTOR信號通路對自噬起重要的負調控作用。

去甲氧基姜黃素(Demethoxy Curcumin,DMC)是傳統中藥姜黃的主要活性成份，作為姜黃素的天然衍生物，二者具有相近的化學結構和相似的藥理作用。姜黃素具有具有抗缺血、抗缺氧、清除氧自由基、抗脂質過氧化、抗細胞內Ca2+超載等多種藥理作用[4]，臨床廣泛用于心力衰竭、動脈粥樣硬化、心律失常等疾病的治療[5-7]，但關于DMC對心血管疾病的作用和機制研究較少。本研究以大鼠心肌缺血再灌注模型為研究對象，以PI3K-Akt-mTOR 信號通路為切入點，探討DMC通過調控細胞自噬減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷的作用及可能機制，為DMC臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級SD大鼠，雄性，體質量(200±20)g，由黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(黑)2016004。大鼠在恒溫恒濕、明暗交替的環境中適應性喂養5 d。

1.2 藥品與主要試劑

去甲氧基姜黃素(DMC)，TTC購自美國Sigma公司；CK-MB、LDH、MDA和SOD檢測試劑盒，購自南京建成生物工程公司；IL-6、IL-1β、TNF-αELISA試劑盒購自武漢博士德生物公司；抗體GAPDH、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、Beclin1、p62、PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt、mTOR、p-mTOR均購自CST公司。RIPA裂解液、BCA試劑盒、BlueRanger預染蛋白質量標準購自美國 MBI公司。

1.3 主要儀器

BL-420F型生物信號采集系統，成都泰盟；DHX-300型小動物呼吸機，成都儀器廠；Multiscan MK3型酶標儀，美國Thermo公司；Olympus CX31正置顯微鏡，日本Olympus公司；2135型組織切片機，德國徠佧；164-5051型電泳儀及轉膜儀，Gel Doc XR型凝膠成像系統，美國Bio-Rad公司。

1.4 分組給藥和模型制備

SD大鼠經心電圖篩選合格后，隨機分為假手術組、模型組、DMC預處理10、15和30 mg/kg組，每組15只。將DMC用二甲亞砜(DMSO)溶解備用，再用生理鹽水稀釋至所需濃度，DMC預處理組大鼠腹腔注射給藥，每日1次，連續7 d；假手術組和模型組給予等量生理鹽水。末次給藥后大鼠禁食不禁水12 h，腹腔注射戊巴比妥鈉75 mg/kg麻醉后位固定，用標準Ⅱ導聯監測大鼠心電圖，并連接呼吸機。沿胸骨左緣鈍性分離肌肉，剪斷第4肋骨，暴露出心臟并打開心包，用無創縫合線在左冠狀動脈前降支起始段下2～3 mm 處結扎。以心電圖S-T段抬高 ≥0.1 mV 或T波高聳，心肌顏色變暗紅色為結扎成功標志，心肌缺血30 min后，打開結扎線再灌注120 min。假手術組大鼠除不結扎外給予相同處理。

1.5 血清指標檢測

再灌注120 min后靜脈取血靜置離心，取血清分裝后置于-20 ℃冰箱中保存備用。按照試劑盒操作說明檢測血清中CK-MB、LDH、MDA、SOD、IL-6、IL-1β和TNF-α水平。

1.6 TTC法檢測大鼠心肌梗死面積

快速取出心臟放入4 ℃生理鹽水清洗心腔內血液后，放入-20 ℃冰箱冷凍25 min。將心臟沿結扎線與房室溝平行方向橫切成5 片，每片厚約2 mm，1% TTC溶液(pH7.4)中37 ℃染色15 min，吸干水分后的放入10%甲醛溶液中固定。正常心肌染為紅色，梗死區心肌呈淡白色。拍照后用Image pro plus6.0圖像分析軟件計算心肌梗死面積，用缺血面積占左心室面積百分比來表示。

1.7 HE染色觀察心肌組織病理變化

取心肌組織10%甲醛溶液中固定24 h，流水沖洗2 h，經脫水、透明、浸蠟后石蠟包埋。切片厚5 μm，常規HE染色，顯微鏡下觀察心肌組織病理變化。

1.8 Western blot檢測心肌組織蛋白表達

取缺血區周圍的心肌組織稱重后放入液氮中保存，采用Western blot法檢測心肌組織中LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、Beclin1、p62、PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表達。取出凍存心肌組織加入適量的液氮充分研磨，用RIPA裂解液提取組織蛋白，BCA測定蛋白濃度，調整各組蛋白濃度，每孔上樣30 μg。經 SDS-PAGE電泳分離、轉膜、封閉后，加入一抗4 ℃孵育過夜，二抗37 ℃孵育1 h，采用ECL法顯色，凝膠成像系統掃描并分析蛋白條帶。

1.9 統計學分析

2 實驗結果

2.1 DMC對MIRI大鼠血清中CK-MB、LDH、MDA和SOD的影響

與假手術組相比較，模型組大鼠血清中CK-MB、LDH和MDA水平顯著升高(P<0.01)，SOD活性顯著降低(P<0.01)；與模型組相比較，DMC預處理組大鼠血清中CK-MB、LDH和MDA水平隨著給藥濃度的增加而逐漸降低(P<0.01)，SOD活性隨著給藥濃度的增加而逐漸升高(P<0.01)，差異有統計學意義。如表1。

2.2 DMC對MIRI大鼠血清中炎癥因子水平和心肌梗死面積的影響

與假手術組相比較，模型組大鼠血清中IL-6、IL-1β和TNF-α水平明顯升高，大鼠心肌梗死面積顯著增加(P<0.01)；與模型組相比較，DMC預處理組大鼠血清中IL-6、IL-1β和TNF-α水平隨著給藥濃度的增加而逐漸降低，大鼠心肌梗死面積逐漸減少(P<0.01)，差異有統計學意義。如表2。

表1 DMC對MIRI大鼠血清中CK-MB、LDH、MDA和SOD水平的影響

表2 DMC對MIRI大鼠血清中炎癥因子水平和心肌梗死面積比率的影響

2.3 DMC對MIRI大鼠心肌組織病理變化的影響

光鏡下可見，假手術組大鼠心肌纖維排列規整，胞質和胞核染色均勻，細胞間無充血和炎細胞浸潤。I/R組大鼠心肌纖維結構紊亂、斷裂，部分心肌細胞溶解、空泡變性，細胞間大量瘀血和炎細胞浸潤。DMC預處理組大鼠心肌組織中上述病理改變隨著給藥濃度的增加在逐漸減輕。如圖1。

圖1 DMC對MIRI大鼠心肌組織病理變化的影響(HE染色×200)

2.4 DMC對MIRI大鼠心肌組織中自噬相關蛋白表達的影響

如圖2和表3所示，與假手術組比較，模型組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值、Beclin1蛋白表達顯著增高(P<0.01)，p62蛋白表達水平顯著降低(P<0.01)，差異有統計學意義；與模型組相比較，DMC預處理組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值、Beclin1蛋白表達降低(P<0.01)，與DMC濃度變化呈負相關，p62蛋白表達水平增高(P<0.01)，與DMC濃度變化呈正相關，差異有統計學意義。

表3 DMC對MIRI大鼠心肌組織中自噬相關蛋白表達的影響

注：1.假手術組；2.1/R模型組；3.DMC低劑量組；4.DMC中劑量組;5.DMC高劑量組

2.5 DMC對MIRI大鼠心肌組織中PI3K-Akt-mTOR信號通路相關蛋白及其磷酸化的影響

如表4和圖3所示，與假手術組比較，模型組p-PI3K蛋白表達和p-PI3K/PI3K比值顯著降低(P<0.01)，差異有統計學意義；與模型組比較，DMC(10、15、30 mg/kg)組的p-PI3K蛋白表達和p-PI3K/PI3K比值均顯著升高(P<0.01)，與 DMC濃度呈正相關，差異有統計學意義。而各組PI3K蛋白表達無統計學意義。

表4 DMC對MIRI大鼠心肌組織中p-PI3K、PI3K蛋白表達的影響

如表5和圖3所示，與假手術組比較，模型組p-Akt蛋白表達和p-Akt/Akt比值顯著降低(P<0.01)，差異有統計學意義；與模型組比較，DMC(10、15、30 mg/kg)組的p-Akt蛋白表達和p-Akt/Akt比值均顯著升高(P<0.01)，與DMC濃度呈正相關，差異有統計學意義。而各組Akt蛋白表達無統計學意義。

表5 DMC對MIRI大鼠心肌組織中p-AKT、AKT蛋白表達的影響

如表6和圖3所示，與假手術組比較，模型組p-mTOR蛋白表達和p-mTOR/mTOR比值顯著降低(P<0.01)，差異有統計學意義；與模型組比較，DMC(10、15、30 mg/kg)組的p-mTOR蛋白表達和p-mTOR/mTOR比值均顯著升高(P<0.01)差異有統計學意義。而各組mTOR蛋白表達無統計學意義。

表6 DMC對MIRI大鼠心肌組織中p-mTOR、mTOR蛋白表達的影響

注：1.假手術組；2.1/R模型組；3.DMC低劑量組；4.DMC中劑量組;5.DMC高劑量組

3 討論

自噬是細胞通過自噬體與溶酶體的結合，來降解自身受損的細胞器和蛋白質的過程，被稱為Ⅱ型細胞程序性死亡。自噬是把雙刃劍，生理狀態下心肌細胞自噬的存在能夠維持內環境穩態，缺血缺氧時期自噬的激活有利于細胞存活，在持續缺血缺氧或再灌注階段，能誘導自噬表達過度增強，對細胞的存活產生不利影響[8-9]。機體對自噬過程的調節較為復雜，有多種信號分子及信號通路參與自噬的調控，其中PI3K-Akt通路是最為經典[10]。

CK和LDH水平變化可以反映出心肌受損傷的嚴重程度，是常用的心肌損傷標記物，通常存在于細胞質內，在心肌細胞受到時缺血缺氧等損傷時，二者就會由心肌細胞滲漏到血液中，使血清中CK、LDH水平顯著升高[11]。為評價MIRI模型大鼠心肌的受損傷程度和DMC干預效果，本研究首先測定了血清中CK-MB、LDH水平，發現I/R模型大鼠血清中CK-MB、LDH水平顯著升高，DMC能明顯降低CK-MB和LDH水平，其效果呈現一定濃度依賴性，表明DMC預處理可以減輕缺血再灌注對大鼠心肌所造成的損傷。通過進一步檢測心肌梗死面積和組織病理學變化 ，發現 DMC能顯著減輕大鼠心肌梗死面積，改善組織病理學損傷。

在 MIRI發生發展的病理進程中，炎癥級聯反應和氧化應激是重要的起始和促進因素，參與了心肌損傷的全過程，其中活性氧(ROS)和炎癥細胞因子對細胞自噬的調控有重要作用。在心肌缺血時期，低氧和ATP能量耗竭引起的細胞器損傷激活了心肌細胞自噬，而在再灌注時期，氧化應激所產生的大量ROS加重了細胞器損傷和脂質過氧化，使細胞自噬被過度激活[12]。MDA是氧化應激過程中脂質過氧化的重要產物，其水平高低反映了脂質過氧化程度，SOD 是體內清除ROS重要的抗氧化酶[13]。MIRI引起缺血區周圍心肌組織炎性浸潤，同時大量釋放TNF-α、IL-6和IL-1β等炎癥細胞因子，通過炎癥級聯反應進一步加重了心肌損傷[14]。本研究結果顯示，DMC預處理能夠顯著提高MIRI大鼠血清中SOD活性，抑制MDA的生成，顯著降低炎癥細胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的水平，且效果呈濃度依賴性變化。表明DMC能夠通過抑制MIRI大鼠心肌氧化應激水平，阻斷炎癥級反應進程，從而起到心肌保護的作用。

LC3、Beclin1、p62蛋白是細胞自噬的重要組成部分，通常作為自噬水平的檢測指標。Beclin1通過與PI3KCⅢ和Atg14結合形成三聚體，使自噬相關蛋白聚集并啟動自噬。LC3 是典型的自噬標志物，對自噬泡的形成起到關鍵作用，分為LC3A、LC3B 和 LC3C三種同工型，其中LC3B 分為LC3-Ⅰ型和LC3-Ⅱ型。LC3-Ⅰ型存在于細胞質中，游離的LC3-Ⅰ型能夠通過泛素化修飾方式轉變為LC3-Ⅱ型，并轉移到自噬體膜上，LC3-Ⅱ數量與自噬體數量成正比[15]，通過LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值大小可評價判斷自噬活性的強弱。p62 能夠和待降解物結合，然后再與LC3Ⅱ形成復合物，最后在溶酶體內被降解，p62會隨著自噬作用的增加而不斷地被消耗[16-17]。為了進一步探討DMC對MIRI時自噬的調控作用，本實驗采用WB法檢測心肌組織中自噬相關蛋白LC3、Beclin1和p62 表達。結果顯示DMC預處理能顯著降低了MIRI大鼠心肌組織中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比率和 Beclin1 蛋白表達，提高p62的蛋白表達，且效果呈濃度依賴性變化。提示自噬參與了MIRI病理進程，表明DMC對心肌細胞過度自噬的激活有明顯的抑制作用。Akt屬于一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是調控mTOR最重要的直接上游分子，PI3K-Akt信號通路激活以后導致Akt活化產生相應的生理效應，細胞內Akt蛋白的磷酸化水平反映了PI3K-Akt信號通路的被激活的程度[18]。mTOR是PI3K/Akt通路下游最關鍵的自噬負調控因子,其活性隨著MIRI所誘導的自噬情況不同而不斷發生動態變化[19]。在MIRI初期mTOR被抑制，心肌細胞自噬不斷增強，在后期為防止自噬過多，mTOR 被激活，抑制自噬直至終止自噬[20]。持續性心肌缺血缺氧和再灌注導致的氧化應激損傷和炎癥級聯反應等病理產物，抑制了mTOR蛋白表達及其磷酸化，ULK1復合體被激活并誘導自噬泡膜形成 ，使mTOR對自噬的抑制作用減弱，自噬活性過度增強[21]。本實驗結果表明，DMC預處理可增加I/R模型大鼠受損心肌細胞中PI3K、Akt和mTOR蛋白的磷酸化水平，從而激活PI3K-Akt-mTOR信號通路。表明DMC對MIRI大鼠心肌細胞自噬作用的抑制主要是通過激活自噬上游的PI3K-Akt-mTOR信號通路實現的。

綜上所述，DMC預處理可能通過PI3K-Akt-mTOR信號通路，抑制細胞自噬的過度激活，從而抑制氧化應激水平，阻斷炎癥級聯反應進程,減少心肌細胞凋亡，對心肌缺血再灌注損傷具有較好保護作用。