他莫昔芬對ER- GPER+乳腺癌細胞上皮間質轉化的影響及機制

王書夢，吳萌，高曉丹，李婷婷

（麗水市中醫院 藥劑科，浙江 麗水 323000）

絕大多數乳腺癌是激素依賴性惡性腫瘤，其生長往往與體內激素密切相關[1]。雌二醇是促進乳腺癌細胞生長的重要激素，能與雌激素受體（estrogen receptor，ER）結合并激活后者的轉錄調節活性，從而促進靶基因的轉錄[2]。他莫昔芬（tamoxifen，TAM）作為人工合成的抗雌激素藥物，可與雌二醇競爭ER，并與ER結合形成穩定的復合物抑制ER的生物活性，進而抑制腫瘤細胞生長[3]。但隨著研究的推進，TAM被證實還能與新型ER-G蛋白偶聯雌激素受體（G protein-coupled estrogen receptor，GPER）結合，觸發后者下游增殖、遷移、侵襲等相關信號分子，促進腫瘤細胞的惡性生物學行為[4-5]。上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition， EMT）是指上皮細胞失去上皮表型而獲得間質細胞表型的生物學過程，可以使腫瘤細胞獲得侵襲和轉移能力[6]。目前鮮見TAM是否能通過GPER介導乳腺癌細胞EMT的研究。本研究以乳腺癌MDA-MB-468細胞（ER-，GPER+）作為研究對象，主要觀察TAM對該類細胞侵襲能力和EMT的影響，并探討GPER的介導作用，為臨床治療乳腺癌提供基礎理論支持。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株與藥品：人乳腺癌MCF-7細胞、MDAMB-231細胞、MDA-MB-468細胞購自中國科學院上海細胞庫；TAM購自美國Sigma Aldrich公司，使用時以DMSO溶解稀釋；GPER特異性抑制劑G15購自德國Cayman公司，使用時以DMSO溶解稀釋。

1.1.2 主要試劑：RPMI1640培養基、DMEM高糖培養基、L15 培養基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）和磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）購自美國Gibco公司；GPER siRNA轉染試劑盒購自上海吉瑪公司；Vimentin抗體、Ecadherin抗體、N-cadherin抗體購自美國CST公司；GAPDH抗體、抗兔IgG-HRP二抗購自北京愛必信公司；蛋白定量試劑盒、細胞裂解液及總蛋白提取試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器：AI600凝膠成像儀，美國GE公司產品；電泳儀、轉膜儀及電源，美國bio-rad公司產品；OptimaTMXPN超速離心機，美國貝克曼公司產品；臺式低速自動平衡離心機L400，湖南湘儀公司產品；DXS-5倒置顯微鏡，上海締倫公司產品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養：乳腺癌MDA-MB-468細胞以含15% FBS及1%青-鏈霉素的L15培養基培養于37 ℃、100%空氣的培養箱中；乳腺癌MCF-7細胞以含10% FBS及1%青-鏈霉素的1640培養基培養于37 ℃、5% CO2、95%空氣的培養箱中；乳腺癌MDA-MB-231細胞以含10% FBS及1%青-鏈霉素的DMEM高糖培養基培養于37 ℃、5% CO2、95%空氣的培養箱中。

1.2.2 TAM處理和G15干預：分為空白對照組（不做任何處理），DMSO組（以0.1% DMSO處理48 h），TAM組[以TAM（5 μmol/L）處理48 h]，G15組[以G15（10 μmol/L）預處理4 h]，TAM+G15組（先以G15預處理4 h，再以TAM處理48 h）。

1.2.3 侵襲實驗檢測細胞的侵襲能力：取出分裝好的Matrigel膠，用L15培養基將Matrigel膠稀釋至0.250 mg/mL。吸取100 μL Matrigel膠稀釋液于Transwell小室中，放置到培養箱靜置3～4 h。制備含所需濃度藥物的培養基，用該培養基分別將MDA-MB-468細胞（必要時提前用G15預處理）制成懸液，調整細胞密度為2×106個/mL，吸取200 μL細胞懸液加入各Transwell小室中。在Transwell小室的下室中加入800 μL L15培養基（含20 FBS），置于培養箱培養48 h。48 h時取出細胞，傾倒出小室內的培養基，PBS洗2遍，將小室置于甲醇中固定細胞15 min，PBS洗2遍，再將小室置于0.5%結晶紫水溶液中染色15 min，將小室在清水中洗2次，取棉簽擦掉小室內房細胞，小室風干10 min。倒置顯微鏡下觀察并取6個視野拍照計數。

1.2.4 siRNA干擾GPER蛋白表達：當MDA-MB-468細胞匯合度達到70%～90%時進行換液處理，30 min后進行siRNA轉染，以250 μL L15培養基溶解5 μL siRNA（包括GPER干擾siRNA和對照siRNA），輕柔混勻，室溫靜置5 min；再以250 μL L15培養基溶解10 μL Lipofectamin2000，輕柔混勻，室溫靜置 5 min；將溶解好的siRNA和Lipofectamin2000混合制成siRNA-Lipofectamin2000混合物，室溫靜置 20 min后加入細胞中完成轉染，轉染后8 h用完全培養基換液。轉染對照siRNA的細胞設為siRNA干擾對照組（siRNA-Con），轉染GPER干擾siRNA的細胞設為GPER干擾組（GPER-siRNA）。將細胞置于37 ℃ 的CO2培養箱中培養24 h，Western blot檢測GPER干擾效率。觀察干擾GPER表達對TAM誘導效應的影響：分為空白對照組（MOCK）、siRNA-Con組、TAM+ siRNA-Con組、siRNA-GPER組及TAM+siRNA-GPER組。分別進行侵襲小室實驗和Western blot實驗。

1.2.5 Western blot檢測蛋白表達：按照需求處理細胞，處理結束后分別以3 mL PBS洗2遍，第2遍PBS保留，用細胞刮刀將各組細胞刮下并轉移至5 mL離心管中，1 200 r/min離心5 min，棄去廢液，各加入RIPA細胞裂解液（含1%蛋白酶混懸顆粒）于冰上裂解10 min，裂解結束后在4 ℃條件下以12 000 r/min 離心20 min，吸取上清液至0.5 mL EP管中并置于冰上，采用BCA蛋白定量試劑盒定量，定量后制備蛋白電泳樣品。SDS-PAGE電泳后轉膜30 min，5%脫脂牛奶封閉PVDF膜4 h后分別用GPER（1:2 000）、Vimentin（1:3 000）、E-cadherin（1:2 000）、Ncadherin（1:1 000）或GAPDH抗體（1:5 000）于4 ℃冰箱孵育過夜。次日，TBST洗膜3次，抗兔IgG-HRP二抗（1:5 000）室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL顯色后凝膠成像儀進行成像，對蛋白印跡條帶進行處理和分析。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS17.0軟件進行分析。正態分布計量資料用±s表示，2組間比較采用t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組細胞GPER和ERα表達水平比較 以MCF-7細胞（GPER+，ER+）作為陽性對照，MDA-MB-231細胞（GPER-，ER-）作為陰性對照，發現MDA-MB-468細胞為GPER陽性、ERα陰性，見圖1。

2.2 各組細胞TAM與G15處理影響細胞侵襲活動 空白對照組和DMSO組細胞侵襲能力差異無統計學意義（P＞0.05）；與DMSO組比，TAM組細胞侵襲能力明顯增強（P＜0.01）；與TAM組比，TAM+G15組細胞侵襲能力顯著減弱（P＜0.01），見圖2。