在流水系統中滸苔對營養鹽吸收和轉化的模擬實驗

丁月旻 , 顏 天 , 耿慧霞 周名江

(1. 中國科學院海洋生態與環境科學重點實驗室, 山東 青島 266071; 2．青島海洋科學與技術試點國家實驗室海洋生態與環境科學功能實驗室, 山東 青島 266237; 3. 中國科學院大學, 北京 100049; 4. 中國科學院海洋大科學研究中心, 山東 青島 266071)

綠潮是世界沿海各地普遍發生的海洋生態災害。近幾十年, 綠潮的發生頻率和地理范圍均呈現增長趨勢[1-2]。黃海綠潮是目前世界范圍內發生規模最大的綠潮災害, 已經嚴重地影響了黃海沿岸城市旅游業和水產養殖業, 破壞了沿海的生態環境[3]。黃海綠潮的肇事種類經鑒定為滸苔(Ulva prolifera)[4]。滸苔較高的生長率及其對海水營養鹽的快速吸收都是該海域綠潮發生的基礎原因[5-6]。大量研究已經表明黃海綠潮發源于黃海江蘇省沿岸淺灘區域[7-8], 該海域的海水質量已呈現富營養化[9]。滸苔綠潮發生的過程一般是先在江蘇南部沿海海域出現, 隨后綠潮的范圍逐漸擴張并順著海流向北移至山東半島海域, 其覆蓋面積可達幾千平方公里[10], 據估算其生物量可達幾百萬噸[11]。

黃海如此大規模的綠潮, 必然會帶來一系列不可忽視的問題。滸苔作為一種大型藻類, 能夠從海水吸收大量的氮磷營養鹽并通過光合作用固定CO2;同時滸苔利用這些無機形態的生源要素轉化為自身需要的物質, 最終隨著其死亡分解再將這些物質釋放到水體中。因此, 滸苔對生源要素的利用可能影響生態系統物質的生物地球化學循環過程。滸苔對生源要素的吸收利用的研究應從兩方面開展: 滸苔對生源要素的吸收以及滸苔對生源要素的轉化。目前, 滸苔對氮、磷營養鹽的吸收動力學和吸收速率主要都是采用靜止的、水體不流動的培養體系開展實驗[5,12-13], 當然也有部分研究是在海水圍隔系統中開展模擬實驗[14]。

本研究建立了一個新的培養體系-流水系統, 運用并模擬了海水中氮、磷營養鹽在不斷供給的情況下滸苔對它們的吸收和利用, 還測定了滸苔對碳、氮、磷3 種生源要素在藻體內的轉化速率, 討論了滸苔在生態系統物質循環中的作用, 將為探討滸苔綠潮對生態系統的生態效應提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗用滸苔

于山東省青島市匯泉灣采集漂浮的綠潮藻, 經分子生物學方法結合形態學觀察, 鑒定為滸苔(Ulva prolifera), 用過濾滅菌的海水洗滌滸苔, 去除泥沙和附著物, 放置于室內培養架的錐形瓶內, 溫度為18～20℃, 光強為50 μmol·m–2·s–1, 光照時間14 L: 10 D。培養液為自然海水(取自青島太平角)經0.45 μm 的濾膜過濾, 然后在溫度121℃, 氣壓0.56 kg·cm–2, 蒸汽滅菌30 min, 冷卻至室溫, 并添加f/2 培養液配方。

實驗前所用滸苔均在經0.22 μm 過濾的自然海水中培養一周, 每日更換海水。實驗中所用玻璃儀器均用1︰9 的鹽酸浸泡后高溫滅菌(121℃, 30 min)。實驗所用的海水均為經0.22 μm 濾膜過濾后的自然海水。

1.2 實驗設計

本實驗中所涉及的各種營養鹽分別用簡寫代替全稱, 具體指代如下:

DIN(溶解無機氮); DON(溶解有機氮); DTN(溶解態總氮); TN(總氮); DIP(溶解無機磷); DOP(溶解有機磷); DTP(溶解態總磷); DIC(溶解無機碳);DTC(溶解總碳)。

1.2.1 實驗用培養滸苔的流動水裝置

本實驗采用流動水裝置(圖1)培養滸苔。其中, 1-(a)為供水瓶(5 L), 裝有經0.22 μm 纖維濾膜過濾的自然海水; 1-(b)為滸苔培養瓶(1 L), 裝有滸苔; 1-(c)為出水瓶(5 L), 接收培養瓶中流出的海水。a 瓶和b 瓶以及b瓶和c 瓶之間落差約15 cm。連接a 和b 的是一根醫用注射管, 可控制流入培養瓶的海水流速, 接入b 培養瓶中的管頭置于培養瓶底部。連接b 和c 的是一根普通軟管, 當b 培養瓶中海水高于該管出口, 海水便會自動溢出。三個瓶口均用濾紙包裹, 不密封。

1.2.2 滸苔在流動系統中對碳、氮、磷的吸收和轉化

經預實驗調整培養瓶的入水流速保持在0.375 L·h–1。實驗開始將b 培養瓶中加入700 mL 海水, 放入2.5 g 濕重的滸苔約112 min 后, 接入出水瓶。實驗裝置置于溫度為18～20℃, 光強為50 μmol·m–2·s–1, 光照時間12 L: 12 D 的培養條件下。每隔12 h, 在a 瓶中添加4.5 L 經0.22 μm 纖維濾膜過濾的自然海水, 取出c 接收瓶中的海水, 一部分水樣經0.45 μm 的纖維濾膜過濾后加入三氯甲烷保存于–20℃, 用于測定水體中的、DTN 和DTP; 另一部分經濾膜過濾后加入1 滴飽和氯化汞, 保存于4℃,用于測定DIC、DTC。實驗時間持續5 天, 每個實驗組設置3 個平行。取實驗前后的滸苔樣品, 測定藻體體內的TC、TN、TP、。本實驗自然海水的營養鹽平均起始濃度,: 21.36±2.015 μmol·L–1,: 0.25±0.007 μmol·L–1,: 0.93±0.071 μmol·L–1,DON: 5.45 μmol·L–1,: 0.465±0.092 μmol·L–1,DOP: 0.282 μmol·L–1,: 28.47±0.01 mmol·L–1。實驗共持續120 h, 其中第1—12 h、第25—36 h、第49—60 h、第73—84 h、和第97—108 h 為光照時段, 第13—24 h、第37—48 h、第61—72 h、第84—96 h和第109—120 h 為非光照時段。

圖1 培養滸苔的流動水裝置Fig. 1 Flowing water device for culturing U. prolifera

1.3 測定方法

根據海洋調查規范(GB 17378.4—2007), 水體中的測定方法分別為鋅-鎘還原法、萘乙二胺分光光度法、次溴酸鹽氧化法和磷鉬藍分光光度法; 水體TN和TP 的測定采用過硫酸鉀氧化法。水體中DTS 的測定方法參考GB/T 17776—1999硝酸消解-氯化鋇比濁法并稍作改進。取樣品0.5 mL,加5 mL 硝酸(1.04 mol·L–1)溶液水浴煮2.5 h。冷卻后, 加入5 mL 穩定劑, 定容至50 mL。向水樣各加入1 mL 氯化鋇溶液, 攪拌均勻后超聲10 min。靜置5 min 后于440 nm 波長下測定吸光值。水體的DIC和DTC 的測定方法采用德國Elementar 公司的總有機碳分析儀直接測定。

滸苔體內的TC、TN 和TP 測定前, 藻體樣品于60℃烘箱烘干2 h 至恒重, 錫舟包樣, 待測。滸苔體內的TOC 測定前, 取烘干樣品銀舟裝樣, 滴加1 mol·L–1HCl 溶液進行去無機碳處理, 60℃烘箱烘干, 直至樣品滴加HCl 不再產生氣泡, 包樣待測。TC、TOC 和TN 采用德國Elementar 公司的元素分析儀加樣測定;TP 的測定取烘干的樣品由美國PerkinElmer 的電感耦合等離子體發射光譜儀(ICP-AES)測定。滸苔體內的的測定和的測定分別選用了李靖等[15]和趙海超[16]的測定方法。

測定滸苔干重與濕重的方法: 取一定重量滸苔于60℃烘箱烘干2 h 至恒重, 分別稱量滸苔被烘干前的濕重(g)和滸苔烘干后恒定的干重(g)。

1.4 數據處理

1.4.1 營養鹽濃度:

1.4.2 營養鹽的吸收

其中, X0是營養鹽的起始濃度(μmol·L–1); Xtb和Xtc分別是t 時間后b瓶中和c瓶中海水營養鹽的濃度(μmol·L–1);Vtb和Vtc分別是t 時間收集時b 瓶中和c 瓶中海水的體積(L); V 是b 瓶中和c 瓶中海水的體積之和(L); Nt是t時間后滸苔的生物量(g); t 是時間(d)。為了降低取樣過程對b 瓶營養鹽的干擾, 不對滸苔培養瓶直接取樣, 計算過程中采用的b 瓶中的營養鹽濃度與c 瓶相同。

不同光照條件下滸苔藻體對營養鹽吸收速率的差別得用統計學軟件SPSS 進行方差分析(ANOVA,analysis of variance), 通過Shapiro-Wilks 方法對數據進行正態性檢驗, 通過Levene 方法對數據進行方差齊性檢驗。

1.4.3 滸苔對營養鹽的轉化

其中, Wt為滸苔增重后的濕重(g); Pt為滸苔增重后某元素的含量的百分比(100%); W0為滸苔實驗前的濕重(g); P0為滸苔實驗前某元素的含量的百分比(100%);0.191 為滸苔干重與濕重的比值(見圖2); t 為時間(d)。

圖2 滸苔干重與鮮重的線性關系Fig. 2 Linear relationship between the dry weight and fresh weight of U. prolifera

滸苔將無機態的元素轉化為有機態的轉化效率e 計算:

其中, 氮和磷的理論上吸收無機形態元素的量(μmol),是海水中無機形態所占該元素總量的比例與藻體內元素積累量進行乘積。理論上吸收無機碳的量(μmol)為吸收的空氣中CO2的量與海水中無機碳減少的量二者的總和; CO2的吸收量(μmol)為滸苔體內所積累的總碳量與海水中總碳的消耗量的差值, 在此忽略碳元素被容器或藻體本身的吸附作用。

2 結果

2.1 在流動水體中滸苔對氮、磷營養鹽的吸收

在流動海水體系研究中, 計算出滸苔每12 h 對氮磷營養鹽的吸收量。從圖3 中看到, 流動水培養體系中,這四種有機和無機的營養鹽的吸收量均為正數, 說明滸苔對DIN、DON、DIP 和DOP 都是具有吸收作用的。其中, 滸苔對無機氮和總氮的吸收量隨著時間的變化呈現增加的趨勢, 這應該是滸苔生長以及生物量有所增加, 吸收了更多的氮營養鹽。而滸苔對DIP 和DTP的吸收量隨著時間變化維持較穩定的趨勢。滸苔對DON 和DOP 的吸收量沒有明顯的變化趨勢。對每12 h收集的海水中無機營養鹽和有機營養鹽的比例進行研究(圖3)。發現, 與起始海水中DIN 所占海水DTN 的比例相比, 經過培養滸苔的海水中DIN 的比例越來越低。而從滸苔培養海水的DIP 占DTP 的比例圖中, 沒有明顯的變化趨勢。以上說明, 滸苔能夠明顯改變海水中無機氮和有機氮營養鹽的比例。

圖3 流動水體中滸苔對氮、磷營養鹽的吸收量和水體中有機和無機營養鹽的比例Fig. 3 Uptake of nitrogen and phosphorus nutrients by U. prolifera and the proportion of nutrients in the flowing seawater

按照營養吸收速率的公式計算出每個時段內滸苔對各種氮、磷營養鹽的吸收速率(表1), 發現, 每個時段營養鹽平均吸收速率的高低與其吸收量具有相同的趨勢。僅第0—24 h 和第37—48 h 兩個時段的DIN 和DTN 平均吸收速率數值低于其他時段的吸收速率; 而第0—36 h 的DIP 和DOP 的平均吸收速率略高于其他時段的吸收速率。以上說明在這個流水系統中滸苔對各個營養鹽的吸收速率比較穩定, 沒有明顯的變化趨勢。對比光照和非光照時段發現, 在光照時段內滸苔對DIN、DIP、DOP 的平均吸收速率略高于在黑暗時段的平均吸收速率, 而滸苔在光照時段對DON 的吸收速率略低于在黑暗時段的平均吸收速率。光照時段滸苔對DTN 和DTP 的平均吸收速率均略高于黑暗時段的平均吸收速率。分析數據發現, 光照時段的滸苔對DIN、DON、DIP、DOP、DTN 和DTP的平均吸收速率與黑暗時段的平均吸收速率并沒有顯著差異(P>0.05)。光照對滸苔吸收氮磷營養鹽的速率沒有明顯影響。5 天內, 滸苔對DIN、DON、DIP和DOP 的平均吸收速率分別為10.87 μmol·g–1·d–1、2.41 μmol·g–1·d–1、0.183 μmol·g–1·d–1和0.023 μmol·g–1·d–1。

2.2 營養鹽的轉化

本研究計算了海水中主要的3 種生源要素在海水中的消耗。從表2 結果看到, 滸苔培養體系的海水中無機形態的營養鹽消耗量均高于該元素的有機形態消耗量。其中, 無機氮和無機磷的消耗分別占總氮和總磷的87.9%和75.4%, 而無機碳消耗量占總碳消耗量的比例最低, 但是這個數值并不能代表實際上真正的無機碳的消耗量和總碳的消耗量的比值, 因為空氣中有一部分CO2進入實驗體系中, 以無機碳的形式被吸收。

對滸苔體內主要的3 種生源要素的有機和無機形態測定(表2), 結果顯示, 在滸苔的體內, 有機形態成分均遠高于無機形態成分, 這是生物體吸收同化無機物并轉化為有機物以供自身生長代謝的重要特點。5 天內在滸苔體中, 無機氮和無機碳的增長僅占總氮和總碳增長的2.3%左右, 無機磷的增加不到總磷增加量的0.01%, 以上說明無機氮和無機碳進入滸苔機體內很快被轉化成為有機氮和有機碳。滸苔對吸收的無機氮、無機磷和無機碳同化為有機形態的轉化效率分別為: 97.33%, 99.99%和 96.84%。在整個實驗體系內, 所測得海水中生源物質的減少量與滸苔體內生源物質的增長量有一定差異, 可能是海水中的營養物質被容器或滸苔吸附而沒有被滸苔所吸收造成的。

表1 流動水體中滸苔對氮磷營養鹽的吸收速率/(μmol·g–1·d–1)Tab. 1 Uptake rate of nitrogen and phosphorus nutrients in the flowing seawater by U. prolifera

表2 海水中營養鹽的消耗與滸苔內營養物質的轉化Tab. 2 Consumption of nutrients in seawater and the transformation of nutrients by U. prolifera

3 討論

3.1 流水系統中滸苔的氮、磷吸收速率

在普通實驗的氮、磷吸收的研究中, 需要短時間內(第0—12 h)監測水體中的營養鹽濃度, 一般都是一次性添加營養鹽。如果要做連續的營養鹽補充實驗, 需要每日或者定時向培養系統中添加營養鹽,實驗過程工作量較大且不足以反映現場條件下滸苔對營養鹽的吸收過程。本研究設計的流水系統能給藻體創造一個相對穩定的培養環境, 以模擬海水不斷更新以及補充營養鹽的過程, 并且營養鹽的補充速度能夠被控制。用這個系統來進行模擬實驗, 既可以避免現場圍隔實驗環境因子的不確定性, 也能夠較準確地量化滸苔對海水中氮磷營養鹽的吸收情況。從得到的數據結果看(表1), 5 d 內滸苔對各個營養鹽的吸收速率很穩定, 說明在流水系統中滸苔的生長狀態是比較穩定的。

本研究結果中滸苔對DIN、DON、DIP 和DOP一直都有吸收作用, 其平均吸收速率分別為 10.87 μmol·g–1·d–1、2.41 μmol·g–1·d–1、0.183 μmol·g–1·d–1和0.023 μmol·g–1·d–1。與其他學者的結果進行比較, 史華明[13]和吳曉文等[14]等學者的研究發現滸苔對硝態氮的吸收速率均高于100 μmol·g–1·d–1, 因為他們培養滸苔的水體都添加了營養鹽, 提高了水體的氮磷營養鹽的濃度, 而黃海現場海水的營養鹽濃度并達不到實驗設置的濃度。本研究采用自然海水, 可以更好地反映現場條件下滸苔對氮磷營養鹽的吸收情況。同時李瑞香等[17]對不做任何添加的海水圍隔實驗中, 得到氮的平均吸收速率為 6.48 μmol·g–1·d–1,磷的平均吸收速率為0.9 μmol·g–1·d–1, 明顯低于本研究中的氮磷平均吸收速率, 而本研究中原始的海水營養鹽濃度與該圍隔中的濃度相差不大。吸收速率有差異的原因可能是因為現場圍隔實驗的環境因子(如天氣、污染等)有太多的不確定性, 而海水的補充作用沒法考慮在其中。Li[18]等通過室內培養實驗發現滸苔不僅可以快速吸收海水中的無機態營養鹽,同樣對尿素、甘氨酸、腺苷三磷酸及葡萄糖-6-磷酸等小分子有機營養鹽也具有較高的吸收速率。

從流水系統中, 五天內收集的溢出的海水的營養鹽濃度來看, 海水中的DIN 的濃度約為10 μmol/L,說明流動體系的海水中氮營養鹽沒有消耗完全; 而且DIN 的吸收量確實還隨著時間的變化(滸苔生物量的生長)呈現增長趨勢, 因此以本實驗的DIN 吸收速率來模擬滸苔在黃海綠潮發生過程中的吸收速率是可以采用的。而溢出的海水中PO34-的濃度很低, 其吸收量在整個5 天內沒有太大的變化。來自青島海域的海水中PO34-為磷限制, 且限制作用較為明顯。而發生綠潮的黃海, 也是典型的磷限制海域[19]。那么本研究流水系統下滸苔對磷營養鹽的吸收速率可能與滸苔在黃海綠潮發生過程中的吸收速率比較一致。

從滸苔培養海水中的營養鹽變化看, 海水中的無機氮和有機氮不僅濃度降低了, 而且在水體中的比例也有所改變, 起始海水中無機氮濃度比有機氮濃度為4︰1, 實驗后此比值為1.5︰1 到19︰1)。不同的氮源的比例和濃度均會影響海洋藻類的生長、營養組成以及一系列生命活動[20-22]; 混合氮源下, 不同比例的氮源也會影響藻類的生長和光合作用[19,23]; 不同比例的氮源還會影響藻類之間的生長競爭[24-25]。營養鹽結構和氮源比例的變化很有可能會影響整個生態系統的結構和生物多樣性。

3.2 滸苔對生源要素的轉化效率

從滸苔對海水中無機碳和總碳的消耗量的比值來看, 這個數值并不能代表實際上真正的實際值,因為空氣中的CO2是能夠溶于海水中的。特別在海水中無機碳濃度有所消耗和下降時, 空氣中的CO2能加快其溶于水的速度。因此, 在整個研究體系中,CO2進入該體系的量是未知的, 在此實驗中無機碳的消耗量占總碳消耗量的比值高于61%。從滸苔的總碳的增長量來看, 忽略海水中的各種形態的碳的被吸附作用, 5 d 內應該有4.835 mmol 的CO2被吸收。那么, 被滸苔吸收的CO2與DIC 的比例為1︰1.4, 由此看來, 滸苔對CO2的吸收和固定的能力很強, 如果綠潮暴發, 空氣中大量的CO2將被吸收固定, 這對碳的海洋物質循環過程有很大的影響。

本研究結果表明滸苔對無機磷轉化效率達99.99%, 而且滸苔體內無機磷的增長十分的少, 說明滸苔所吸收無機磷幾乎都被轉化成為有機磷, 這可能與海水中磷限制有關。滸苔體內無機磷幾乎全部被轉化利用了, 沒有多余的無機態磷儲存在細胞里。而滸苔對其他無機營養鹽的轉化效率均高于95%, 滸苔將各種無機營養元素同化為自身有機的生命結構, 這也是滸苔的正常生理過程。

滸苔綠潮的暴發會使滸苔吸收海水中的大量碳、氮、磷等生源物質以及大氣中的CO2, 并將這些無機形態的生源要素轉化為有機形態, 從而快速進入物質循環。綠潮滸苔對海水中生源要素的吸收、利用和釋放會加快海洋生態系統的物質循環, 從根本上改變生態系統[26-28]; 綠潮這種特殊的災害可以改變生源要素地球化學循環過程的方向和強度。黃海大規模的綠潮攜帶如此多的有機態生源要素聚集在黃海, 綠潮消亡后可能會對局部海域的生物地球化學循環過程產生影響, 綠潮后期的生態效應還有待進一步研究。

4 結論

黃海綠潮暴發期間以滸苔為主的漂浮綠藻生物量可達數百萬噸, 在綠潮發生、發展和消亡過程中,藻體的快速生長以及死亡分解過程可能會影響海域生源要素的遷移轉化。為探討滸苔在生態系統物質循環中的作用, 本研究在流動海水的模擬系統中研究了滸苔對海水營養鹽的吸收和轉化過程, 發現滸苔藻體對不同形態的氮、磷均有吸收, 而且能夠高效地將無機形態的氮、磷和碳轉化為自身有機形態物質, 這為深入探究黃海綠潮的生態效應提供了重要理論依據。綠潮暴發過程中, 漂浮滸苔能夠實現對海水中營養鹽的快速吸收和轉化, 加快生源物質進入生態系統的物質循環過程, 而藻體腐爛分解過程中又將這些營養物質釋放到水體中, 可能產生一系列生態效應, 值得進一步研究。