肉芽腫性乳腺炎不同中醫證型中免疫相關因子表達變化及臨床意義

劉曉菲，王楠，李斐斐，宋愛莉，張麗美

(1.山東中醫藥大學第一臨床醫學院，山東 濟南 250335；2.山東省中醫藥研究院，山東 濟南 250014)

肉芽腫性乳腺炎又稱肉芽腫性小葉性乳腺炎(granulomatous little mastiffs，GLM),是指乳腺的非干酪樣壞死，局限于小葉的肉芽腫性病變。多數專家認為GLM是一種由多種炎癥細胞和細胞因子參與的免疫相關疾病[1]。中醫因其發病初期以腫塊為主，中期熱盛肉腐成膿，后期破潰流膿形成瘺管或竇道的臨床特點，將其歸屬于乳癰、乳漏范疇[2]。本研究結合臨床及相關文獻[1-5]將本病分為肝郁痰凝證(腫塊期)、熱毒熾盛證(膿腫期)及正虛毒戀證(潰后期)三期，分析山東中醫藥大學附屬醫院手術治療GLM患者的臨床資料，研究其病理學特征及不同證型中相關指標的表達和差異；為治療GLM在免疫學方面提供可參考的臨床依據，以及不同的診療思路。

1 資料與材料

1.1 資料

研究對象均來自于2017年1月—2018年12月于山東中醫藥大學附屬醫院乳腺外科接受手術治療且病理診斷為肉芽腫性乳腺炎的女性患者。排除標準:①未經過系統治療即出院的病例；②病理診斷不明確的患者；③病例資料不完整影響統計分析的病例；④合并其他免疫相關疾病的病例；⑤合并其他乳房疾病如乳房結核，影響結果分析的患者。剔除標準:①治療期間有嚴重不良反應者；②病理組織較小，不足以做免疫組化的病例。

本研究最終納入符合標準的50例患者，按照中醫證型標準分組：肝郁痰凝證(腫塊期)、熱毒熾盛證(膿腫期)、正虛毒戀證(潰后期)。其具體資料如下：腫塊期15例患者，15例已育、0例未育，年齡分布為24～39歲，平均年齡為(31.55±1.03)歲；膿腫期18例患者，17例已育、1例未育，年齡在26～42歲，平均年齡為(33.27±2.21)歲；潰后期17例，17例已育、0例未育，年齡分布為28～40歲，平均年齡為(33.80±1.81)歲。三組患者年齡、已婚已育比例比較均無統計學意義(P>0.05)，研究有可比性。

1.2 中醫證型分期

考慮本病和乳癰的臨床表現相似，參考陳紅風主編的《中醫外科學》乳癰分期、林毅《現代中醫乳房病學》，并結合臨床及相關文獻[1-5]將本病進行分期如下。

(1)肝郁痰凝證(腫塊期):乳房腫塊,質韌硬,形態不規則,境界不清,表面不光滑,活動度較差,疼痛或有壓痛,表面皮膚不紅或微紅,局部皮溫正常或略高；無發熱、惡寒等全身癥狀,少數腋下淋巴結可及腫大；舌淡白或淡紅,苔薄白或白膩，脈沉弦。

(2)熱毒熾盛證(膿腫期):腫塊增大,紅腫熱痛加重,可累及多個象限,有波動感或穿刺有膿液抽出；可伴腋下淋巴結腫大、發熱、惡寒等全身癥狀；舌質紅,苔黃膩,脈滑數。

(3)正虛毒戀證(潰后期):乳房膿腫潰破,膿出不暢,或膿腫切開后失治誤治,膿水淋漓,創面肉色不鮮；伴面色無華，神疲乏力，食欲不振，舌質淡,苔薄白,脈細無力。

1.3 儀器和設備

RM2235切片機(德國LEICA公司)，生物組織攤片烘烤機(湖北亞光醫用電子技術有限公司)，捷達光學顯微鏡550D(沈陽優軟科技發展有限公司)，EG1150H型生物組織包埋機(德國LEICA公司)。

1.4 試劑

兔抗人CD4多克隆抗體(萬類生物科技有限公司，批號：wl0282)，兔抗人CD8多克隆抗體萬類生物科技有限公司，批號：wl0281)，兔抗人TNF-α多克隆抗體萬類生物科技有限公司，批號：wl0334)，兔抗人TNFα-r1(P55)多克隆抗體(萬類生物科技有限公司，批號：wl0338)，SP免疫組化試劑盒(萬類生物科技有限公司，批號：wl0776)，DBA顯色試劑盒(萬類生物科技有限公司，批號：wl0290)，PBS緩沖液(萬類生物科技有限公司，批號:wla102)，二甲苯、蘇木紅、伊紅(上海強順化學試劑有限公司)。

2 方法

2.1 實驗步驟

(1)收集病理蠟塊，連續4 μm切片,每個蠟塊組織切取5張切片,共計305張,分5組即HE染色組、CD4組、CD8組、TNF-α組、P55組。

(2)HE法染色：經二甲苯脫蠟切片，梯度乙醇脫苯，各梯度酒精分別約1～2 min，水洗，蘇木精染細胞核，水洗，伊紅染細胞質，各梯度乙醇脫水，中性樹膠封片。

(3)免疫組化法：①將石蠟切片脫蠟至水;②抗原修復;③加入3%H2O2，室溫10 min以滅活內源性過氧化物酶；④封閉；⑤孵育一抗：滴加適當一抗稀釋液稀釋一抗(分別按說明書濃度)，室溫孵育1～2 h或者4 ℃過夜孵育。TBS沖洗3次，每次1 min。分別以說明書陽性組織做陽性對照，使用TBS緩沖液代替一抗作為陰性對照；⑥孵育二抗：滴加二抗，37 ℃孵育30 min，TBS沖洗3次，每次1 min；⑦DAB顯色;⑧蘇木素復染2～3 min，然后蒸餾水沖洗；⑨封片膠封片、顯微鏡觀察。

2.2 免疫組化評判標準

組織切片中陽性指標是棕黃色或棕褐色顆粒。參考許良中、楊文濤1996年《免疫組織化學反應結果的判斷標準》[6]。

2.3 采集免疫組化圖像測定平均灰度值

每張切片在顯微鏡下隨機選取5個視野并拍照取圖，采用應用丹吉爾灰度軟件計算平均灰度值，灰度值數值越高表示陽性表達越低，數值約低，表示陽性表達越高。

2.4 統計方法

3 結果

3.1 免疫組化鏡下陽性表現

CD4+、CD8+T細胞、TNF-α、P55陽性信號均為黃色或棕褐色顆粒，CD4+、CD8+T細胞定位于胞漿和胞膜，CD4+T細胞主要在膿腔周表達，CD8+T細胞在病變小葉內表達，TNF-α定位于胞漿，在導管上皮、間質內、漿細胞、多核巨細胞表達，P55定位于細胞間質、細胞膜，在導管上皮、間質內、漿細胞、多核巨細胞、血管內皮細胞表達。見圖1。

3.2 不同證型肉芽腫性乳腺炎CD4+、CD8+T細胞、TNF-α、P55表達結果

圖1 不同證型中CD4+、CD8+T細胞、TNF-α、P55陽性表達(免疫組化SP法，×400)

表1 不同證型中CD4+、CD8+、TNF-α和P55表達的灰度值

CD4+T細胞在肝郁痰凝證(腫塊期)與熱毒熾盛證(膿腫期)中表達均高于正虛毒戀證(潰后期)(P<0.05),差異具有統計學意義，在肝郁痰凝證(腫塊期)中表達高于熱毒熾盛證(膿腫期)，差異無統計學意義(P>0.05)。

CD8+T細胞在正虛毒戀證(潰后期)表達高于肝郁痰凝證(腫塊期)與熱毒熾盛證(膿腫期)(P<0.05),差異具有統計學意義，在熱毒熾盛證(膿腫期)中高于肝郁痰凝證(腫塊期)，表達差異無統計學意義(P>0.05)。

TNF-α、P55在肝郁痰凝證表達最明顯，熱毒熾盛證、正虛毒戀證次之,差異均具有統計學差異(P<0.05)。見圖2。

圖2 不同證型中CD4+、CD8+、TNF-α和P55表達的灰度值柱狀圖

3.3 不同證型肉芽腫性乳腺炎CD4+、CD8+T細胞平均灰度值相關性分析

對不同證型肉芽腫性乳腺炎中CD4+、CD8+T細胞平均灰度值進行直線相關性分析，結果顯示r=-0.773,P=0.000,即CD4+、CD8+T細胞在不同證型肉芽腫性乳腺炎的表達變化呈負相關，差異有統計學意義，即隨著CD4+T細胞表達升高CD8+T細胞表達降低，見圖3。

3.4 不同證型肉芽腫性乳腺炎TNF-α、P55平均灰度值相關性分析

對不同證型肉芽腫性乳腺炎中TNF-α、P55平均灰度值進行直線相關性分析，結果顯示r=0.835,P=0.000,即TNF-α、P55在不同證型肉芽腫性乳腺炎的表達變化呈正相關，差異有統計學意義，即隨著TNF-α表達降低，P55表達降低，見圖4。

圖3 CD4+T細胞、CD8+T細胞相關性分析

圖4 TNF-α、P55相關性分析

3.5 不同證型肉芽腫性乳腺炎T細胞亞群與TNF-α平均灰度值相關性分析

對不同證型肉芽腫性乳腺炎中T細胞亞群與TNF-α平均灰度值進行直線相關性分析，結果分別顯示r=0.842,P=0.000,r=-0.864,P=0.000，即在不同證型肉芽腫性乳腺炎TNF-α表達與CD4+T細胞表達呈正相關，與CD8+T細胞表達呈負相關，有統計學意義，見圖5、圖6。

圖5 CD4+T細胞、TNF-α相關性分析

圖6 CD8+T細胞、TNF-α相關性分析

4 討論

肉芽腫性乳腺炎，是指乳腺局限于小葉的非干酪樣壞死的肉芽腫性病變，是一類以肉芽腫為主要病理特點的乳腺慢性炎癥疾病。該病是一種由各種炎癥細胞及細胞因子參與的免疫相關疾病，涉及的細胞及因子包括T細胞、干擾素、腫瘤壞死因子、白介素等[7]。在GLM病變導管內彌漫炎癥反應，分泌的一種或多種物質成為抗原，介導IV型超敏反應。有研究發現，在GLM出現浸潤的淋巴細胞中,免疫組化顯示較多CD3+、CD4+、CD8+細胞浸潤，較少的是CD20+，證實為T細胞浸潤[8]。ERHAN[9]在評估病人免疫組化時發現18例患者中有14例具有T細胞優勢。OGURA等[10]在2例肉芽腫性乳腺炎免疫組化中檢測到有CD4或CD8的淋巴細胞浸潤病灶處。因此在該病的發生機制中機體自身免疫反應起著重要作用[11]。

CD4+T細胞主要效應功能是分泌細胞因子, 這些細胞因子又可作用于相同的T細胞和其他細胞, 起輔助誘導細胞及體液免疫的作用。CD4+T細胞在自身免疫性疾病的發生和發展中起著最重要的作用, 它們所產生的大部分細胞因子皆為激活免疫反應所必需。CD4+T淋巴細胞功能增強, 機體可發生過強的免疫應答, 導致自身免疫性疾病和超敏反應。CD8+T細胞為抑制/殺傷細胞(Ts/Tc)，有抑制細胞及體液免疫的作用。CD4+細胞和CD8+T細胞之間相互協調和制約，產生適度的免疫應答, 使之既能清除異物抗原, 又不至于損傷自身組織，若CD4+細胞過強，則易導致機體自身免疫疾病[12]，T細胞亞群改變，影響局部細胞免疫，則促進肉芽腫性乳腺炎的發生。

腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α) , 又被稱作“惡質素”,是一種重要的促炎細胞因子，具有多種生物學特性，由巨噬細胞、NK細胞、T細胞分泌，促進炎癥反應、調節免疫應答，參與細胞增殖與凋亡等。有研究表明, TNF-α在肉芽腫的形成過程中起重要作用,且已有實驗模型證實肉芽腫的形成與TNF-α在T細胞的募集密切相關[13]。CD4+、CD8+分泌細胞因子參與免疫應答，在遲發性超敏反應的早期，細胞因子TNF-α及其受體P55表達增加[14]。TNF-α促進其他炎癥因子，如IL-2、IL-6等，或可通過誘導下游單核細胞或巨噬細胞等的激活，增加炎癥細胞的活性及聚集性，促進其對組織的浸潤，導致局部炎癥反應，加重損害[12]。

本研究中，CD4+T細胞、TNF-α、P55表達在肝郁痰凝證(腫塊期)最高，熱毒熾盛證(膿腫期)、正虛毒戀證(潰后期)次之；而CD8+T細胞的表達與其相反。相關性分析結果顯示，CD4+、CD8+T細胞二者之間呈負相關；TNF-α與受體P55二者之間呈正相關；在不同證型GLM中，TNF-α、P55表達與CD4+T細胞表達呈正相關，與CD8+T細胞表達呈負相關。

在疾病發生時，自身免疫反應增強，T細胞比例失調，免疫系統紊亂，CD4+T細胞處于高表達狀態、CD8+T細胞反之，免疫功能亢進、抑制功能減弱，導致發生過強的免疫應答。疾病進展時，免疫反應先是持續亢進狀態，CD4+T細胞水平過高、CD8+T細胞水平降低；在后期，CD4+T細胞表達逐漸降低、CD8+T細胞表達升高，自身免疫反應逐漸降低、抑制自身免疫反應增強，疾病趨于平穩狀態，逐漸恢復免疫平衡。因此我們推測，在GLM的治療過程中, 可從免疫調節劑方面著手, 通過下調CD4+T細胞、上調CD8+T細胞來改變T細胞亞群的比例，從而可削弱這種過強的免疫反應，使CD4+T細胞和CD8+T細胞之間達到平衡，為治療肉芽腫性乳腺炎乳腺炎提供新的角度。

TNF-α、P55參與了肉芽腫乳腺炎的發生發展，與肉芽腫的形成密切相關。初期疾病嚴重階段TNF-α的大量釋放，其需與受體結合方能發生作用，因此其受體相應的升高，在疾病的演變中，隨著TNF-α的降低，其受體減少。在疾病發展過程中，TNF-α與其受體P55結合，激活相關通路，招募其他炎癥細胞如白細胞大量聚集在炎癥部位，擴大炎癥反應，局部激活血管內皮細胞, 增加血管通透性，損傷局部微循環等。因此我們推測可以在一定程度上抑制TNF-α因子的釋放，或可以考慮使用TNF-α抑制劑，干擾相關通路，來緩解GLM的嚴重程度，達到治療效果。

綜上所述，在GLM不同中醫證型中，邪正交爭、陰陽盛衰，隨著腫塊期、膿腫期、潰后期病情演變過程，T淋巴細胞與相關細胞因子亦存在免疫調節變化。T淋巴細胞可產生TNF-α，而TNF-α又可刺激T淋巴細胞產生其他相關因子，進一步促進T細胞增殖分化，共同參與疾病的發生發展。這對肉芽腫性乳腺炎的診斷治療提供了不同的治療思路，未來關于GLM的治療必然會多元化、多靶點、多種治療手段共同協作。