D-半乳糖聯合對氯苯丙氨酸致腎不藏志不寐大鼠下丘腦神經遞質和凋亡基因的實驗研究

任小娟，張星平，王慶全，王冠英

(新疆醫科大學附屬中醫醫院，新疆 烏魯木齊 830000)

不寐病隸屬于現代醫學失眠癥，其病因病機復雜，辨證思路多樣，臨床表現各異。中醫治療不寐病具有較好的臨床療效，但由于辨證論治的多樣性導致其重復性較低。本課題組根據《黃帝內經》的五神理論、藏象理論以及后世醫家相關理論，結合五臟辨證提出中醫不寐五神分型診斷法[1]。該分型與五臟辨證相吻合[2]，受中醫師個體辨證傾向影響較小，客觀性強，可操作性、可重復性強，也頗有療效，便于臨床、科研推廣運用。具體包括腎不藏志不寐、心不藏神不寐、肺不藏魄不寐、肝不藏魂不寐和脾不藏意不寐。其中腎不藏志不寐為中醫不寐五神分型中較為常見的證型，主癥為夜寐早寤，病位在腎，其病因為陰、陽、氣、血、痰、瘀、寒、熱等各種原因導致腎臟的虛損，核心病機是腎志不入于舍，即腎不藏志[3]。

腎不藏志不寐是以早寤(早醒)為主要臨床特征，多見老年人。這不僅與我們前期腎不藏志不寐臨床研究相一致，而且與ANWAR E AHMED研究所發現的老年失眠多導睡眠圖(PSG)中早醒的睡眠特征相吻合[4]。故我們選擇衰老大鼠進行睡眠剝奪建立腎不藏志不寐大鼠。D-半乳糖致亞急性衰老和對氯苯丙氨酸(PCPA)致失眠是衰老研究和失眠研究中常用經典造模方法[5-6]。有研究發現抑制性神經遞質γ-氨基丁酸(GABA)與睡眠有著密切聯系[7]；凋亡蛋白B細胞淋巴瘤基因-2(Bcl-2)和促凋亡因子Bcl-2相關X蛋白(Bax)不僅與衰老有關[8]，還與睡眠密切相關[9]。因此，本實驗采用D-半乳糖聯合PCPA建立腎不藏志不寐大鼠，從神經遞質和凋亡基因角度，觀察該模型大鼠下丘腦神經遞質和凋亡基因表達的變化，通過定位航行探索運動軌跡熱圖觀察該模型大鼠的學習記憶能力，為腎不藏志不寐的進一步研究奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

SPF級雄性大鼠40只，體質量(200±20)g，由新疆醫科大學動物實驗中心提供，許可證號：SYXK(新)2018-0003。造模前將各組大鼠適應飼養1周后隨機分成4組，每組10只，包括：空白對照組、老年組、失眠組和腎不藏志不寐組(模型組)。

1.2 主要藥品與試劑

D-半乳糖，北京索來寶公司(批號：1013G051)；對氯苯丙氨酸(PCPA)，美國Sigma公司(批號：SHBJ7057)；熒光定量PCR試劑盒由日本Takara公司提供。GABAARα1、GABAARβ2、GABAARγ2、Bax、Bcl-2引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。引物序列見表1。

1.3 動物模型的建立

大鼠適應性飼養1周，然后每組大鼠予以對應處理，具體如下。

空白對照組：大鼠予以生理鹽水120 mg/kg頸背部皮下注射，每日1次，連續42 d，然后生理鹽水300 mg/kg腹腔注射，每日1次，連續3 d；老年組：大鼠予以D-半乳糖120 mg/kg頸背部皮下注射，每日1次，連續42 d，然后予生理鹽水300 mg/kg腹腔注射，每日1次，連續3 d；失眠組：大鼠予以生理鹽水120 mg/kg頸背部皮下注射，每日1次，連續42 d，然后PCPA 300 mg/kg腹腔注射，每日1次，連續3 d；腎不藏志不寐組：大鼠予以D-半乳糖120 mg/kg頸背部皮下注射，每日1次，連續42 d，然后PCPA 300 mg/kg腹腔注射，每日1次，連續3 d。

1.4 檢測指標

1.4.1 大鼠體質量變化

造模結束后(第46天)，測量各組大鼠體質量，觀察各組大鼠體質量變化。

1.4.2 大鼠定位航行探索運動軌跡的比較

采用Morris水迷宮觀察大鼠的空間學習記憶能力，利用水迷宮裝置觀察大鼠找到平臺所需的時間，于第6天記錄大鼠找到目標平臺的定位航行探索運動軌跡，比較各組大鼠定位航行探索運動軌跡。

1.4.3 下丘腦GABAARα1、GABAARβ2、GABAARγ2mRNA相對表達量的測定

造模結束了，水合氯醛麻醉大鼠，冰上取大鼠腦組織，分離下丘腦，提取mRNA用于RT-PCR實驗。RNA提取及cDNA合成參照試劑盒說明書進行，合成cDNA進行PCR擴增。采用 Primer 3軟件設計 RT-PCR 引物，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。PCR 擴增條件：95 ℃預變性10 min,95 ℃變性10 s，退火10 s(退火溫度：GABAARα1亞單位為60 ℃、GABAARβ2亞單位為60 ℃、GABAARγ2亞單位為60 ℃)，72 ℃延伸10 s，40個循環后，95 ℃延伸15 s，60 ℃延伸1 min。將目的基因擴增結果經內參照校正后，以空白對照組目的基因擴增結果作為對照，2-△△ct法表達為mRNA的相對表達，計算其余各樣本與空白對照組的比值，作相對定量分析，最終結果以相對定量結果表示。

1.4.4 下丘腦Bax、Bcl-2 mRNA相對表達量的測定

下丘腦cDNA合成步驟同上。采用 Primer 3軟件設計RT-PCR引物，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。PCR 擴增條件：95 ℃預變性10 min,95 ℃變性10 s，退火10 s(退火溫度：Bax亞單位為62 ℃、Bcl-2亞單位為62 ℃)，余步驟同上。

1.5 統計學分析

2 結果

2.1 體質量的比較

與空白對照組比較，模型組大鼠體質量明顯減少(P<0.01；與模型組比較，失眠組、老年組大鼠體質量均明顯增加(P<0.01)。見圖1。

注:A:空白對照組；B:老年組；C:失眠組；D:模型組；與空白組比較，##P<0.01;與模型組比較，**P<0.01圖1 各組大鼠體質量變化

2.2 定位航行探索運動軌跡的比較

與空白對照組比較，失眠組、老年組和模型組運動軌跡均明顯延長，其中模型組找到目標靶平臺運動軌跡最長。軌跡熱圖見圖2。

2.3 下丘腦GABAARα1、GABAARβ2、GABAARγ2 mRNA的相對表達量

與空白組比較，模型組大鼠下丘腦GABAARα1、GABAARβ2、GABAARγ2mRNA的相對表達量均顯著減少(P<0.05，P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，老年組大鼠下丘腦GABAARα1的相對表達量顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，失眠組大鼠下丘腦GABAARβ2的相對表達量顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，老年組和失眠組大鼠下丘腦GABAARγ2的相對表達量無明顯變化(P>0.05)。見圖3。

2.4 下丘腦Bax、Bcl-2 mRNA的相對表達量

與空白組比較，老年組、模型組大鼠下丘腦Bax mRNA的相對表達量顯著增加(P<0.05)，老年組、模型組大鼠下丘腦Bcl-2mRNA的相對表達量顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，失眠組下丘腦Bax mRNA的相對表達量顯著減少(P<0.05)，失眠組大鼠下丘腦Bcl-2 mRNA的相對表達量顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，老年組大鼠下丘腦Bax和Bcl-2 mRNA的相對表達量無顯著變化(P>0.05)。見圖4。

注:A:空白對照組；B:老年組；C:失眠組；D:模型組；與空白組比較，#P<0.05，##P<0.01;與模型組比較，*P<0.05圖3 下丘腦GABAARα1、GABAARβ2、GABAARγ2mRNA的相對表達量

3 討論

有研究發現老年人隨著年齡的增加會伴隨認知能力的下降[10]，失眠會增加老年人癡呆的風險[11]，這說明老年失眠會出現認知能力的下降。Morris水迷宮(MWM)實驗可以分析動物的定位導航能力和空間探索能力，是推斷實驗動物的學習記憶能力的常用方法[12]。本實驗發現腎不藏志不寐大鼠探索目標平臺的運動軌跡明顯長于正常大鼠，提示腎不藏志不寐大鼠學習記憶能力下降。

γ-氨基丁酸(GABA)是中樞神經系統中主要的抑制性神經遞質，它能夠抑制神經系統的神經元，具有神經保護作用，能夠起到催眠、鎮靜和抗焦慮等功能[13]。GABA是通過與其受體相結合產生神經抑制性作用發揮鎮靜作用，其受體包括GABAA受體(GABAAR)、GABAB受體(GABABR)和GABAC受體(GABACR)[14]。其中GABAAR是離子通道型受體，是很多臨床常用的鎮靜、抗焦慮及抗驚厥藥等的靶受體[15]。GABAARα1、GABAARβ2、GABAARγ2型受體較常見，它們對睡眠的調節作用起著重要的影響[16]。JO K[17]研究發現黃精的水提取物能夠增加大鼠皮質GABAARγ2蛋白表達從而改善睡眠。本研究發現腎不藏志不寐大鼠下丘腦GABAARα1、GABAARβ2、GABAARγ2mRNA的相對表達量均低于對照組，提示腎不藏志不寐的機制可能與下丘腦抑制性神經遞質GABA基因表達下降有關。

睡眠具有保護神經元，防止和修復神經細胞損傷的作用[18]。B細胞淋巴瘤基因-2(Bcl-2)蛋白家族是第一個被發現參與凋亡調控過程的基因家族，在細胞凋亡過程中起著重要的調節作用[19]。Bcl-2家族成員由抗凋亡蛋白(Bcl-2，Bcl-2L和Bcl-w)和促凋亡蛋白(Bax，Bak，Bad，Bim和Bit等)組成[20]。其主要功能是直接調節線粒體膜的滲透性，調節促凋亡因子Bax的釋放，從而發揮抗凋亡或促凋亡的作用。促凋亡成員和抑凋亡成員的比例可促進或抑制細胞凋亡的發生，其中以Bcl-2和Bax最具代表性[21]。有研究發現Bcl-2/Bax比例在晚上睡眠時間最高，而在失眠24 h之后發現Bcl-2/Bax比例會下降[22]。ARTAMOKHINAI V等發現Bcl-2、Bax在睡眠覺醒周期中也發揮著重要作用[23]。本研究發現腎不藏志不寐大鼠下丘腦Bcl-2 mRNA的相對表達量低于對照組，Bax mRNA的相對表達量高于對照組，提示腎不藏志不寐的機制可能與下丘腦神經細胞凋亡有關。

本實驗研究了D-半乳糖聯合PCPA建立的腎不藏志不寐大鼠下丘腦神經遞質和凋亡基因。結果表明，腎不藏志不寐大鼠下丘腦神經遞質基因GABAARα1、GABAARβ2、GABAARγ2mRNA的表達較正常對照組下調，下丘腦凋亡基因Bcl-2 mRNA的表達較正常對照組下調，Bax mRNA的表達較正常對照組上調。腎不藏志不寐大鼠模型的建立是腎不藏志不寐臨床研究和實驗研究的基礎，神經遞質和凋亡基因的調控可以作為腎不藏志不寐實驗研究的新的切入點。