QuCHERS-UHPLC-MS/MS法測定畜中雙氯芬酸鈉殘留量

王乾麗，毛敏霞，黃永橋，馬凱，陶光燦，李占彬*

貴州省分析測試研究院（貴陽 550014）

雙氯芬酸鈉（Diclofenac sodium）為非甾體類抗炎鎮痛藥，屬苯乙酸類衍生物，主要通過抑制環氧合酶減少前列腺素的合成從而起到抗炎、鎮痛、解熱的作用[1-3]。近年來，雙氯芬酸鈉在臨床上被廣泛使用，該藥物的安全問題也越來越受到關注，如造成腎臟、肝臟及坯胎等損害的不良反應[4-5]。雙氯芬酸鈉在畜禽養殖中主要用于動物關節炎、神經痛引起的發熱、炎癥等，能改善肉雞的腿瘸和蛋雞的斷喙性能，但是該藥物對禽類有較大毒性，歐盟已經批準雙氯芬酸鈉可以用于豬和牛，并制定了其最大殘留限量（MRLs），在國內尚未批準用于動物，也未制定相關最大殘留限量[6-7]。2005年，山東省藥品不良反應監測中心將雙氯芬酸等19種非甾體抗炎藥列為不良反應重點監測品種，以加強安全性監測[8]。

目前，針對雙氯芬酸鈉的分析檢測，國家質量監督檢驗檢疫總局發布SN/T 2190—2008《進出口動物源性食品中非甾體類抗炎藥殘留量檢測方法 液相色譜-質譜/質譜法》[9]，文獻報道的檢測方法主要有高效液相色譜法、高效液相色譜-串聯質譜法、氣相色譜法、氣相色譜-串聯質譜法[10-18]。這些方法樣品前處理過程繁瑣，耗時長，且目標物損失較多，很難滿足快速篩查的要求；而QuEChERS法作為一種樣品前處理快速凈化方法，未見應用于畜肉中雙氯芬酸鈉殘留量的檢測分析中。此次試驗基于QuEChERS技術對藥品進行前處理，結合超高效液相色譜-串聯質譜分析手段建立畜肉中雙氯芬酸鈉殘留的檢測方法，該方法具有簡單、快速、準確度和精密度好等優點，適用于大批量樣品的快速分析檢測，為企業和食品安全監管部門提供有效的技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器和試劑

1.1.1 主要儀器與設備

Agilent 1290 超高效液相色譜儀、Agilent 6470 QQQ三重串聯四級桿質譜，配有ESI源（美國Agilent公司）；攪拌機Blixer3（法國ROBOT COUPA公司）；LT2002電子天平（常熟市天量儀器有限公司）；UMV-2多管渦旋混合器（北京普立泰科儀器有限公司）；Milli-Q超純水機（美國Millipore公司）；陶瓷均質子（迪馬科技有限公司）；十八烷基鍵合硅膠（C18）吸附劑（上海安普實驗科技股份有限公司）；無水硫酸鈉（天津市科密歐化學試劑有限公司）；0.22 μm PTFE濾膜（上海安普）。

1.1.2 主要試劑

甲醇、乙腈（色譜純，德國Merck公司）；乙酸乙酯（分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司）；甲酸（色譜純，上海安普實驗科技股份有限公司）；乙酸銨（分析純、西亞試劑）；雙氯芬酸鈉（純度＞99%，德國Dr. Ehrenstorfer公司）。

1.2 標準溶液配制

精密稱取10 mg雙氯芬酸鈉（精確至0.000 1 g）于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容刻度，混勻，配制成質量濃度為1 000 mg/L標準儲備液，于-18℃避光保存6個月。移取100.0 μL標準儲備液于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容，配制成10 mg/L的標準溶液，移取100.0 μL標準儲備液于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容，配制成100 μg/L的標準溶液，備用。

1.3 色譜條件

色譜柱，ZORBAX Eclipse Plus-C18反相色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm，美國Agilent公司）；流動相A，0.1%甲酸水溶液，B，乙腈；流速，0.3 mL/min；柱溫，40 ℃；進樣體積，2.0 μL；梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相洗脫梯度

1.4 質譜條件

離子源，電噴霧離子源（ESI），正離子掃描；多反應監測（MRM）；毛細管電壓，4.5 kV；霧化器壓力，45 psi；干燥氣流速，10 L/min；干燥氣溫度，300 ℃；鞘氣流速，10 L/min；鞘氣溫度，300 ℃；其他質譜條件見表2。

表2 其他質譜條件

1.5 樣品前處理

稱取5.00 g搗碎后的組織樣品于50 mL具塞離心管中，準確加入10 mL乙腈，加入1粒陶瓷均質子，渦旋振蕩10 min，以4 500 r/min常溫離心10 min，吸取2 mL上清液于15 mL離心管中，加入900 mg無水硫酸鈉和100 mg C18吸附劑，渦旋1 min，以5 000 r/min離心2 min，取上清液過0.22 μm PTFE濾膜，待測。

1.6 基質工作曲線配制

依次吸取不同體積的標準使用液加入相同取樣量的3種空白基質樣品中（牛肉、羊肉、豬肉），樣品按1.5小節的方法處理后得到3種基質工作曲線，分別對3種樣品進行定量校正。雙氯芬酸鈉的基質標準工作曲線范圍為0.25～10.00 ng/mL。

2 結果與分析

2.1 樣品前處理的優化

2.1.1 提取

選用空白豬肉、牛肉、羊肉陰性樣品，分別考察了乙腈、0.1%甲酸乙腈、乙酸乙酯和0.1%甲酸乙酸乙酯的提取效率，結果見圖1。3種畜肉基質中乙腈和0.1%甲酸乙腈的提取效果優于乙酸乙酯和0.1%甲酸乙酸乙酯的提取效果，且乙腈的提取效果好于0.1%甲酸乙腈，因此選擇乙腈作為樣品提取溶劑。

試驗對渦旋振蕩提取的時間（5，10和15 min）進行了優化，結果發現，在5～10 min時，隨著時間的延長，提取效果明顯增大，10 min以后隨著時間的增加，提取效果基本趨于穩定，故選用渦旋振蕩10 min作為樣品提取時間。

圖1 不同提取溶劑回收率比較

2.1.2 凈化

目前，除了市售已有的產品，常用的吸附劑有C18、PSA、GCB等。此次試驗對QuEChERS dSPE EMR-Lipid凈化管（美國Agilent公司）、Oasis PRiME HLB固相萃取小柱（美國Waters公司，無需活化及淋洗、上樣直接收集濾液）及C18吸附劑進行了考察。結果表明，使用QuEChERS dSPE EMR-Lipid凈化管和Oasis PRiME HLB固相萃取小柱凈化時，目標物基本被填料完全吸附；使用C18吸附劑凈化時，目標物損失較少。試驗進一步對C18粉的用量（50，100和200 mg）進行了優化，結果表明，使用100 mg C18粉凈化樣品時，凈化效果較好，且目標物損失較少。

為加強樣品凈化效果，試驗進一步對PSA吸附劑的用量（50，100和200 mg）進行了優化。結果發現，使用PSA吸附劑時樣品凈化效果更好，但是PSA吸附劑對雙氯芬酸鈉有較強的吸附，導致雙氯芬酸鈉的損失較大，故試驗選擇不加入PSA吸附劑。此次試驗還對無水硫酸鈉的用量進行了考察，最終確定使用900 mg無水硫酸鈉。綜合考慮，使用900 mg無水硫酸鈉和100 mg C18吸附劑作為樣品前處理方法。

2.2 色譜條件的優化

試驗分別考察了乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水含2 mmol/L乙酸銨溶液、甲醇-0.1%甲酸水、甲醇-0.1%甲酸水含2 mmol/L乙酸銨溶液等不同洗脫體系對目標物分離能力。結果表明，使用乙腈-0.1%甲酸水作為流動相時，目標物有良好的色譜分離效果，色譜峰峰型更好，且有較好的響應值，進一步對梯度洗脫程序進行優化，目標物有較好的分離，縮短樣品分析時間，提高分析效率；試驗考察了25，30，40和50 ℃不同柱溫對目標物的影響，結果表明采用40 ℃的柱溫時目標物有較好的響應值，從而確立了最佳色譜條件，樣品單次分析時間僅需3.5 min，滿足大批樣品的快速檢測分析。

2.3 質譜條件的優化

根據雙氯芬酸鈉含有羧基的化學結構特點，可在酸性條件下得到H+而形成較為穩定的[M+H]+準分子離子，在正離子模式下一級全掃描質譜得到分子離子峰（[M+H]+，296.1），通過優化錐孔電壓，對母離子進行二級質譜分析，得到子離子特征碎片質譜圖，選擇特征碎片中離子中響應值高、基線噪聲低的離子對作為定性離子對，選擇響應值最高的離子對作為定量離子對，優化子離子對碰撞能量，使其豐度最大；進一步優化毛細管電壓、霧化器壓力、干燥和鞘氣的溫度及壓力等質譜參數，使其離子化效率最佳，得到最優的質譜條件。

2.4 方法學評價

2.4.1 基質效應的評價及消除

基質效應是指基質成分和目標化合物在進行離子化時相互競爭而導致目標化合物信號強度有不同程度的增強或減弱的現象，包括基質增強效應和基質抑制效應。盡管樣品經過沉淀蛋白、分散固相萃取后取得了良好的凈化效果，但仍無法完全消除基質效應，而基質效應的存在會對檢測結果的準確性產生影響。因而在建立UHPLC-MS/MS檢測方法時應對基質效應進行評價，為保證結果的準確可靠，采取措施消除或減弱其影響是非常必要的。

采用空白樣品處理液加標曲線法（基質匹配標準曲線）評價基質效應，即基質效應ME=（基質配標準溶液曲線斜率/無基質標準溶液曲線斜率-1）×100%[19]，負值表示存在基質抑制效應，正值表示存在基質增強效應，絕對值越大則基質效應越強。從表3可以看出雙氯芬酸鈉在豬肉、羊肉、牛肉中均存在基質效應，且均為基質抑制效應，抑制效應較大。

表3 雙氯芬酸鈉的基質效應

2.4.2 方法的標準曲線、檢出限、定量限

采用基質工作曲線作為定量曲線。選取豬肉、牛肉和羊肉3種陰性樣品，吸取不同量的標準使用液加入3種空白樣品中，按照1.5小節的方法處理后經超高效液相色譜-質譜聯用儀檢測。以標準溶液定量離子對峰面積（Y）對其質量濃度（X，μg/L）作標準曲線，得到3種基質的工作曲線。結果表明，雙氯芬酸鈉在0.25～10.00 μg/L的質量濃度范圍內呈現良好的線性關系，相關系數（R2）在0.996以上，適用于定量分析。通過向陰性樣品中添加目標物來考察方法的檢出限（LOD，S/N=3）和定量限（LOQ，S/N=10），最終確定方法的檢出限（LOD）為0.5 μg/kg，定量限（LOQ）為1.5 μg/kg，結果見表4，說明該方法具有較好的靈敏度。

表4 雙氯芬酸鈉的線性范圍、線性方程、相關系數（R2）、檢出限（LOD）及定量限（LOQ）

2.5 加標回收及精密度考察

選取豬肉、牛肉和羊肉陰性樣品，分別添加0.5，1和2 μg/kg 3個不同濃度的標準溶液，每個添加水平做6個平行試驗，按照1.5小節的方法進行提取凈化，3個加標濃度連續做3 d，分別計算精密度，精密度以變異系數（CV）表示。標準溶液、空白樣品和加標樣品見圖2，結果如表5所示。3個添加水平的日內平均回收率分別為：豬肉86.9%～93.3%，牛肉90.9%～99.0%和羊肉87.3%～96.1%；日內變異系數（CV）分別為：豬肉2.3%～4.8%，牛肉5.1%～5.8%和羊肉4.4%～5.2%；日間平均回收率分別為：豬肉89.6%～94.1%，牛肉87.7%～96.1%和羊肉88.1%～94.9%；日間變異系數（CV）分別為：豬肉2.1%～9.0%，牛肉3.7%～8.2%和羊肉2.1%～4.0%。結果表明，該方法具有較好的重復性與準確性，能夠滿足豬肉、牛肉、羊肉樣品中雙氯芬酸鈉殘留量的測定。

圖2 MRM色譜圖

表5 畜肉中雙氯芬酸鈉的添加回收率和精密度

2.6 實際樣品檢測

選取了50個批次的市售豬肉樣品、20個批次的市售牛肉樣品和10個批次的市售羊肉樣品，每個樣品平行測定2次，按此次試驗建立的方法進行測定，其中有3份豬肉樣品和1份牛肉樣品雙氯芬酸鈉檢測結果呈陽性，豬肉檢測結果分別為3.04，9.43和19.27 μg/kg，牛肉檢測結果為6.65 μg/kg，其余樣品均未檢出。

3 結論

采用超高效液相色譜-串聯質譜儀建立了豬肉、牛肉、羊肉中雙氯芬酸鈉殘留量的快速檢測方法，對樣品前處理、液相色譜、質譜等條件進行優化，樣品用乙腈提取劑，經QuEChERS試劑凈化。結果表明，雙氯芬酸鈉在3.5 min內完成分析，相關系數（R2）在0.996以上，檢出限為0.5 μg/kg；在0.5，1和2 μg/kg 3個添加水平的日內平均回收率分別為：豬肉86.9%～93.3%，牛肉90.9%～99.0%和羊肉87.3%～96.1%；日內變異系數（CV）分別為：豬肉2.3%～4.8%，牛肉5.1%～5.8%和羊肉4.4%～5.2%；日間平均回收率分別為：豬肉89.6%～94.1%，牛肉87.7%～96.1%和羊肉88.1%～94.9%；日間變異系數（CV）分別為：豬肉2.1%～9.0%，牛肉3.7%～8.2%和羊肉2.1%～4.0%。該方法操作簡單準確，回收率高，靈敏度和重現性好，能夠準確定性和定量雙氯芬酸鈉，為豬肉、牛肉、羊肉中雙氯芬酸鈉殘留量的檢測提供技術支撐，為監管部門及食品安全提供更多的理論依據。