豬肉中硝基咪唑類藥物殘留快速測定方法

王斌，牛記者，董丹丹，郭柏坤，王蓮芳，上官苗苗

杭州市余杭區(qū)食品藥品監(jiān)測中心（杭州 311199）

硝基咪唑類藥物（Nitromidazoles，NMZs）具有抗原蟲和抗厭氧菌活性，曾被廣泛用于預(yù)防和治療畜禽肉、水產(chǎn)品組織中寄生蟲相關(guān)疾病。常見的硝基咪唑類藥物及其代謝物有甲硝唑（Metronidazole，MNZ）、地美硝唑（Dimetridazole，DMZ）、洛硝達唑（Ronidazole，RNZ）和羥基甲硝唑（MNZOH）等[1-2]。但由于這類藥物可能存在致癌性、致畸性，對人體健康產(chǎn)生危害[3]，我國于2002年禁用了該類藥物，在動物性食品中均不得檢出[4]。因此加強對動物源性食品中硝基咪唑類藥物及代謝物殘留的檢測能力和監(jiān)測力度具有重要意義[5]。

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有較好的靈敏度和特異性，是目前檢測硝基咪唑類藥物的優(yōu)選方法，也是我國現(xiàn)行動物源性食品中硝基咪唑類藥物的主檢方法[6-8]。液質(zhì)法測定硝基咪唑類藥物的前處理凈化方法主要有固相萃取[9]、分散固相萃取[1]、基質(zhì)分散固相萃取[10]、超分子溶劑液液微萃取[11]、QuEChERS[12]、在線凈化[13]等。試驗以豬肉為研究對象，采取了幾種不同類別的凈化劑對樣品進行前處理，探討不同凈化方式對硝基咪唑類藥物的影響，并對檢測方法進行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

1.1.1 主要材料

硝基咪唑類藥物標準物質(zhì)（德國Dr.公司）；乙腈、甲醇（色譜純，美國默克公司）；甲酸（色譜純，美國Sigma公司）；豬肉（市售）。凈化組N1（100 mg N-丙基乙二胺吸附劑PSA，50 mg十八烷基鍵合硅膠吸附劑C18，20 mg石墨化碳黑吸附劑GCB，400 mg無水硫酸鎂）。凈化組N2（100 mg N-丙基乙二胺吸附劑PSA，40 mg十八烷基鍵合硅膠吸附劑C18，600 mg無水硫酸鎂）。凈化組N3（固相萃取小柱Oasis Prime HLB，200 mg/6 mL，美國Waters公司）。

1.1.2 主要儀器

LC-30AD/API 4000 Plus高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（島津液相-美國AB質(zhì)譜）；ZMQSJ0001超純水器（美國Millipore公司）；BS124S電子天平（德國賽多利斯股份公司）；3-30K冷凍離心機（美國Sigma公司）；MTN-2800W氮吹濃縮裝置（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準溶液配制

通過純度折算，精確稱取各種標準品，用色譜級甲醇溶解稀釋并定容成1 mg/mL，作為儲備母液于冷凍避光保存（低于-18 ℃）。配成質(zhì)量濃度為10 μg/mL混合標準溶液，作為中間儲備液。使用前將混合標準儲備液配制成不同濃度的標準工作液。

1.2.2 樣品前處理

（1）樣品中目標物的提取。稱樣：參考張炯愷[14]的方法，準確稱取5 g（精確至0.01 g）均質(zhì)后的豬肉樣品于干凈離心管中，準確加入10 mL 0.2%甲酸乙腈溶液，均質(zhì)，用高速冷凍離心機在4 ℃ 8 000 r/min下離心10 min，取上清液，備用。

（2）樣品提取液的凈化。凈化組N1：取全部上清液，向其中加入QuEChERS凈化組N1，渦旋混勻2 min，在4 ℃ 8 000 r/min下離心5 min，收集上清液。凈化組N2：取全部上清液，向其中加入QuEChERS凈化組N2，渦旋混勻2 min，在4 ℃ 8 000 r/min下離心5 min，收集上清液。凈化組N3：取全部上清液，過Oasis Prime HLB固相萃取小柱（200 mg/6 mL），控制柱后流速為約1 s/滴，收集流出液。

1.2.3 樣品凈化液的濃縮和定容

將上述凈化液在45 ℃下氮吹至近干，加入20%甲醇水溶液復(fù)溶并定容至1 mL。旋渦混勻數(shù)分鐘，然后靜置一段時間，取上清液過聚醚砜水相針式濾膜（孔徑0.22 μm），待上機檢測。

1.2.4 儀器條件

（1）色譜條件。色譜柱，C18柱（內(nèi)徑1.7 μm；柱長2.1 mm×100 mm；Waters Acquity uplc BEH）；水相流動相（流動相A），一級純水（添加0.1%甲酸）；有機流動相（流動相B），甲醇（添加0.1%甲酸）；流速，0.4 mL/min；柱溫，40 ℃；進樣量，5 μL；梯度洗脫程序，0.0～3.0 min，95%～90% A；3.0～5.0 min，90%～60% A；5.0～6.0 min，60%～5% A；6.0～6.5 min，5% A；6.5～7.0 min，5%～95% A；7.0～8.0 min，95% A。

（2）質(zhì)譜條件。離子源，ESI；噴霧電壓（IS），5 500 V；霧化器壓力（GS1），55 psi；氣簾氣壓力（CUR），25 psi；輔助氣壓力（GS2），55 psi；離子源溫度（TEM），550 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

根據(jù)目標物的結(jié)構(gòu)特點，在高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀上首先通過Q1 SCAN模式確定母離子的質(zhì)荷比，然后通過Product Ion Scan模式選定該母離子產(chǎn)生的子離子的質(zhì)荷比，根據(jù)前兩步驟選出母離子和對應(yīng)的子離子信息，組建該化合物相應(yīng)的離子對，設(shè)定峰高響應(yīng)最高的離子對作為該化合物的定量離子對。在MRM模式下，優(yōu)化每組離子對的碰撞能量和去簇電壓，使之在儀器上的響應(yīng)達到最佳。優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 質(zhì)譜參數(shù)表

2.2 色譜條件的優(yōu)化

在正離子掃描的液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)中，甲酸能提高化合物的離子化效率，并且甲酸作為溶劑改性劑也能更好地改善獸藥化合物的峰形和分離度，增強化合物的響應(yīng)信號[15]，因此在該方法的兩類流動相中，均添加有0.1%甲酸。另外，此次試驗還對照了水（含0.1%甲酸）-乙腈（含0.1%甲酸）流動相體系和水（含0.1%甲酸）-甲醇（含0.1%甲酸）溶液流動相體系。

試驗發(fā)現(xiàn)，在水（含0.1%甲酸）-乙腈（含0.1%甲酸）流動相體系，目標峰均有不同程度的拖尾現(xiàn)象，尤其是DMZ和RNZ拖尾明顯；在水（含0.1%甲酸）-甲醇（含0.1%甲酸）溶液流動相體系條件下，大部分化合物目標離子峰形得到了明顯改善，而且各物質(zhì)的響應(yīng)值也有明顯提高。因此選擇甲醇（含0.1%甲酸）和水（含0.1%甲酸）組成的體系作為此次試驗的流動相。

2.3 不同凈化方式對硝基咪唑類藥物殘留的影響

傳統(tǒng)的硝基咪唑類藥物殘留的檢測需要用凝膠色譜進行凈化處理[6-7]，由于凝膠色譜耗時周期長，工作效率低，而且有機試劑使用量大，對實驗人員的健康也有影響。因此參考了國家標準中獸藥殘留檢測采取的QuEChERS凈化技術(shù)[16]，并結(jié)合新型的凈化固相萃取小柱，對樣品提取液分別進行凈化處理。添加相同水平（相當(dāng)于樣液濃度2.5 ng/mL）的提取液，分別用3種不同的凈化方式進行凈處理，然后以同樣的條件進行濃縮和定容，對比不同凈化組分中硝基咪唑類藥物的色譜峰。

從圖1～圖4可以看出，4種硝基咪唑類藥物在凈化效果和目標物的保留上表現(xiàn)不同。具體來講，地美硝唑（DMZ）在3種凈化劑中均出現(xiàn)了較強的雜質(zhì)峰，凈化組N1和凈化組N2處理后的雜峰干擾過大，影響定性的判斷，而凈化組N3中干擾峰得到明顯改善；羥基甲硝唑（MNZOH）也有雜質(zhì)峰的出現(xiàn)，洛硝達唑（RNZ）在兩組QuEChERS凈化組分中出現(xiàn)較強的雜質(zhì)峰，而甲硝唑（MNZ）在3種凈化劑雜質(zhì)干擾均較少。從幾種物質(zhì)的響應(yīng)值來看，4種硝基咪唑類藥物在凈化組N3中的響應(yīng)值均明顯高于其他兩組，這可能和凈化劑的凈化機理以及目標物的特性有關(guān)[17]。故最終選定凈化組N3作為凈化劑。

圖1 不同凈化處理甲硝唑（MNZ）色譜圖

圖2 不同凈化處理地美硝唑（DMZ）色譜圖

圖3 不同凈化處理洛硝達唑（RNZ）色譜圖

圖4 不同凈化處理羥基甲硝唑（MNZOH）色譜圖

2.4 回歸方程的驗證

分別配制了1.0，2.5，5，10，15和25 ng/mL系列標準工作液，采用1.2節(jié)的分析條件，以每種物質(zhì)的質(zhì)量濃度為橫坐標，定量離子峰的峰面積（CPS）為縱坐標，建立曲線，得到線性回歸方程。由表2可以看出，硝基咪唑類4種代表性物質(zhì)質(zhì)量濃度在1.0～25 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2≥0.991。

表2 曲線范圍、回歸方程及相關(guān)系數(shù)

2.5 不同添加水平對硝基咪唑類藥物殘留回收率的影響

硝基咪唑類藥物國家標準中的檢出限為0.5 μg/kg。為了研究檢測方法的靈敏性，設(shè)定0.25 μg/kg為檢測定量低限。分別添加1，2和10倍定量低限含量水平（0.25，0.50和2.5 μg/kg）的標準物質(zhì)，進行基質(zhì)空白加標回收試驗，每個水平上進行6次獨立平行加標操作，來驗證該方法的回收率和精密度，結(jié)果見表3。低點加標回收率范圍為76.7%～105.6%，中點加標回收率范圍為84.0%～107.1%，高點加標回收率范圍為87.8%～102.0%；由每個水平的6次平行試驗分別計算出相對標準偏差，結(jié)果表明低點加標RSD≤13.9%，中點加標RSD≤4.2%，高點加標RSD≤2.5%。該方法的回收率和精密度均達到了GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》規(guī)定的要求，表明試驗建立的樣品前處理和檢測方法具有良好的回收率和精密度。

表3 3種添加水平中硝基咪唑類藥物的加標回收率和精密度

3 結(jié)論

此次試驗對豬肉中硝基咪唑類藥物殘留快速檢驗技術(shù)進行了研究。考察了色譜流動相條件，發(fā)現(xiàn)甲醇（含0.1%甲酸）和水（含0.1%甲酸）組成的流動相體系更適合分離硝基咪唑類藥物殘留；優(yōu)化了提取液的凈化方式，發(fā)現(xiàn)固相萃取小柱Oasis Prime HLB的凈化效果最優(yōu)。在優(yōu)化的條件下，結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法建立了一種簡單、快速、高效且能同時準確定性和定量檢測的方法。方法的驗證結(jié)果表明，該方法可以滿足日常樣品的檢測要求，且0.25 μg/kg的方法檢出限也可滿足市場及相關(guān)機構(gòu)初步篩查要求，為快速監(jiān)測豬肉乃至動物性源食品中的硝基咪唑類藥物的殘留水平提供有力的技術(shù)支撐。