液質聯用測定蜂蜜中鉤吻堿和鉤吻堿子

羅達龍，王華，陳超杰*，鐘家良，姚泳成

1. 梧州市食品藥品檢驗所（梧州 543002）；2. 梧州學院（梧州 543002）

鉤吻堿類生物堿主要存在于馬錢科植物胡蔓藤（Gelsemium elegans（Gardn. et Champ.）Benth.）中，俗稱斷腸草，民間有用藥史，常用于跌打損傷、骨折、皮膚濕疹等，因其有大毒，主要作為外用，誤服能致命，由于誤食含鉤吻堿和鉤吻堿子的野生蜂蜜而導致中毒的報道也屢見不鮮，文獻[1]報道廣西環江、羅城兩地發生3起食用含鉤吻堿和鉤吻堿子的野生蜂蜜中毒，共造成13人中毒、3人死亡。2015—2016年，梧州地區共發生2起因誤食鉤吻（斷腸草）引起的生物堿中毒事件，造成6人中毒1人死亡。在廣東茂名市公安局早期《鉤吻堿中毒40例尸檢分析》中，記載利用鉤吻投毒致死15人、服鉤吻自殺20人、為治病服藥5人事件[2]，由此可見因誤食鉤吻導致中毒或死亡的案例時有發生。建立快速、準確、靈敏度高的檢測方案很有必要。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

液相色譜儀為Agilent LC-1290（購于美國安捷倫公司）；質譜儀為Agilent QQQ-6490（購于美國安捷倫公司）；離心機（轉速≥3 000 r/min）；全自動平行濃縮儀（AutoEVA-60，睿科儀器有限公司）；超聲波發生器（Eimasonic P180H）；天平：感量分別為0.01 mg，0.1 mg和0.01 g。

鉤吻堿（鉤吻素甲、貨號NACC60513、純度≥98%、中國廣州分析測試中心）；鉤吻堿子（鉤吻素子、貨號NACC60512、純度≥98%、中國廣州分析測試中心）。

甲醇、甲酸、乙腈（色譜純，美國歐姆尼公司）；氨水、鹽酸（國藥集團化學試劑有限公司）；MCX固相萃取柱（型號Creole MCX 60 mg/3 mL，美國歐姆尼公司）；0.22 μm有機濾膜（美國歐姆尼公司）。試驗用水為經ELGA PURELAB Classic UVF凈化系統過濾的去離子水。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準溶液的配制

標準儲備液（1 mg/mL）：精密稱取鉤吻堿、鉤吻堿子標準品各10 mg，分別置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成質量濃度為1 mg/mL標準儲備液。-20 ℃避光貯存，有效期6個月。

混合標準中間工作溶液（1 μg/mL）：分別準確吸取標準儲備液（1 mg/mL）各0.10 mL，用甲醇稀釋至100 mL，搖勻，制成1 μg/mL的混合標準工作溶液。

混合標準工作溶液：分別準確吸取適量混合標準中間工作液（1 μg/mL），用50%甲醇水（含0.1%甲酸）溶劑稀釋，搖勻，作為系列混合標準工作溶液，各化合物質量濃度依次為1，2，8，10和20 ng/mL。

1.2.2 樣品前處理

稱取1 g（精確至0.01 g）制備均勻的樣品置于100 mL一次性離心管中，加入1%鹽酸水溶液至50 mL，渦旋振蕩2 min后超聲處理（100 W，40 kHz）30 min，以3 000 r/min離心5 min，吸取5.00 mL上清液到已活化的MCX柱（依次用甲醇3 mL、水3 mL活化），依次用5 mL水、5 mL甲醇淋洗，棄去全部流出液，抽干MCX柱，用5 mL 5%氨化甲醇洗脫，收集洗脫液，并于40℃氮吹至干，加入溶劑1.00 mL 50%甲醇水（含0.1%甲酸）溶解殘渣，過0.22 μm有機濾膜，備用。

1.2.3 液相色譜與質譜條件

色譜柱：ACE Ultra Core C18（2.5 μm，2.1 mm×75 mm）。流動相A為乙腈，流動相B為0.1%甲酸水溶液（含5 mmol/L甲酸銨）。流速0.35 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量0.50 μL；電噴霧源離子源（ESI），正離子方式，多反應監測（MRM），載氣溫度200℃，載氣流量14 L/min，霧化器壓力25 Psi，鞘氣溫度350 ℃，鞘氣流量12 L/min，毛細管電壓3 500 V。

表1 梯度洗脫程序

2 結果與分析

2.1 質譜條件優化

用溶劑50%甲醇水（含0.1%甲酸）分別配制鉤吻堿、鉤吻堿子，質量濃度分別為1 μg/mL。在儀器調諧通過后分別對上述2個物質進行全掃描，得到全掃描一級質譜數據后進行二級質譜數據采集，對所得到的子離子的質譜參數進行逐個優化，優化后化合物質譜參數詳見表2，二級質譜圖見圖1和圖2。

表2 鉤吻堿與鉤吻堿子質譜參數

圖1 鉤吻堿二級質譜圖

圖2 鉤吻堿子二級質譜圖

2.2 前處理條件優化

2.2.1 提取條件優化

試驗考察純化水、0.5%鹽酸水溶液、1%鹽酸水溶液、1.5%鹽酸水溶液和2%鹽酸水溶液對添加鉤吻堿和鉤吻堿子標準溶液的野生蜂蜜進行同步提取、稀釋后上機測定。通過對比考察所用的溶劑對鉤吻堿和鉤吻素子的提取效率來確定所用的提取溶劑。由于鉤吻堿和鉤吻堿子均為生物堿物質，在酸性溶液提取下物質轉為非離子化狀態，使其在水中不易解離，提高了其溶解性。試驗結果表明用1%鹽酸水溶液提取的鉤吻堿和鉤吻堿子提取效率最高，故選用1%鹽酸水溶液作為提取溶劑。不同溶劑提取下的提取效率詳見圖3。

圖3 不同溶劑提取下的提取效率

2.2.2 凈化條件優化

對比1%鹽酸水直接提取樣品（無凈化）、經MCX固相萃取柱凈化和C18固相萃取柱凈化后的樣品。結果顯示，在1%鹽酸水直接提取的基礎上通過MCX固相萃取柱將生物堿成分富集后再凈化的效果非常明顯，C18固相萃取柱使生物堿損失量較大，生物堿含量明顯低于用MCX凈化的樣品；1%鹽酸水直接提取樣品（無凈化），則干擾物質較多，因此不宜采用。試驗采用MCX固相萃取柱作為凈化方式。MCX固相萃取柱以混合型強陽離子交換反相吸附劑為基礎，由PLS吸附劑鍵合磺酸基團得到，兼具陽離子交換和反相兩種保留模式，適用于其共軛酸的pKa值處于2～10之間的堿性化合物。其保留機理以強陽離子交換相互作用和非極性相互作用為主，極性相互作用為次。適用于堿性化合物萃取。通過把待測物富集在MCX柱上，用水、甲醇淋洗除去試樣中的糖和酯類等非極性干擾物，用堿性溶液洗脫收集，濃縮后溶解上機測定。

2.3 方法的線性范圍及檢出限、定量限

2.3.1 方法線性

鉤吻堿標準品溶液工作曲線在14～284 μg/kg（質量濃度1.4～28.4 ng/mL）范圍內線性關系良好，線性方程y=5 116.072 769x-1 015.616 631，相關系數R=0.999；鉤吻堿子標準品溶液工作曲線在10～200 μg/kg（質量濃度1.0～20.0 ng/mL）范圍內線性關系良好，線性方程y=644.826 518x-56.355 908，相關系數R=0.999。

2.3.2 方法的檢出限、定量限

以加標試驗來進行方法靈敏度的確定。以鉤吻堿、鉤吻堿子定性離子信噪比≥3來確定檢出限，經試驗鉤吻堿檢出質量濃度可達到0.28 ng/mL，鉤吻堿子檢出質量濃度可達到0.2 ng/mL。以鉤吻堿、鉤吻堿子定量離子信噪比≥10來確定定量限，經試驗鉤吻堿檢出質量濃度可達到0.56 ng/mL，鉤吻堿子檢出質量濃度可達到0.4 ng/mL。最終確定稱樣量1.00 g，稀釋倍數10時，方法鉤吻堿檢出限為2.8 μg/kg、鉤吻堿子檢出限為2.0 μg/kg；鉤吻堿定量限為5.6 μg/kg、鉤吻堿子定量限為4.0 μg/kg。

2.4 回收率及精密度試驗

2.4.1 回收率試驗

鉤吻堿在28～280 μg/kg、鉤吻堿子在20～200 μg/kg（蜂蜜基質）低、中、高3個加標濃度回收率詳見表3，該試驗中回收率試驗的RSD均小于5%，說明方法準確度高。

表3 鉤吻堿、鉤吻堿子在蜂蜜基質中的回收率

2.4.2 精密度試驗

鉤吻堿在28～70 μg/kg、鉤吻堿子在20～50 μg/kg（蜂蜜基質）低、中、高3個加標濃度，每個濃度平行樣品2份且連續進樣6針，計偏差，鉤吻堿的蜂蜜基質相對標準偏差為0.9%～3.0%，鉤吻堿子的蜂蜜基質相對標準偏差為0.8%～2.7%。該試驗中基質的精密度試驗RSD均小于5%，說明儀器精密度良好。結果詳見表4。

表4 精密度試驗結果

2.5 基質效應考察

基質效應（ME）是指在樣品測試過程中，目標化合物以外的其他物質直接或間接影響質譜檢測的現象。一般采用空白樣品前處理凈化后添加標準品的方法來評價基質效應。|ME|≤10%，提示基質效應較小，可用溶劑標準曲線進行定量；10%＜|ME|≤50%，提示基質效應較大，若用溶劑外標法定量回收率達不到要求，則需要用基質標準曲線進行定量以消除基質效應對結果的影響；|ME|＞50%，提示基質效應很強，嚴重影響定量，需要重新優化樣品前處理方法。

將空白基質試樣按標準前處理方法進行提取、凈化后獲得空白基質提取液，分別使用空白基質提取液和50%甲醇水（含0.1%甲酸）溶劑將鉤吻堿和鉤吻堿子配制成質量濃度2，8和20 ng/mL的基質標準溶液和溶劑標準溶液；進行檢測，計算基質效應，結果均在95%～105%范圍內，說明經方法提取和凈化后，基質效應不明顯，故標準曲線用50%甲醇水（含0.1%甲酸）溶劑配制標準系列濃度也適用于該標準的檢測。考察結果詳見表5。

表5 基質效應考察結果

2.6 重復性試驗結果

稱取蜂蜜基質各5份1.00 g樣品置于離心管中，分別加入標準液使鉤吻堿含量為280 μg/kg，鉤吻堿子含量為200 μg/kg。按2.2前處理方法，提取，凈化并檢測。結果顯示，蜂蜜基質中鉤吻堿的相對標準偏差為1.8%，鉤吻堿子的相對標準偏差為3.2%。該試驗中蜂蜜基質的重復性試驗RSD均小于5%，說明方法重現性良好。詳見表6。

表6 重復性試驗結果

3 結論與結論

由于鉤吻含鉤吻堿、鉤吻堿子等生物堿，其可在酸性條件下形成非離子狀態，更容易溶解于水中，繼而經過與強陽離子交換反相吸附劑固相萃取柱的作用吸附，用水與有機相淋洗除去雜質后，用堿性溶液洗脫，收集洗脫液，可達到凈化的作用。

斷腸草中毒起病快，按中毒量的多少臨床表現，所以以臨床癥狀、表現判斷是否鉤吻中毒有一定的難度[1-8]，且對于中毒的劑量分析、分析速度和準確性都極為重要。監測鉤吻生物堿常見的主要方法有薄層色譜法[9]、氣相色譜法[10]、液相色譜法[11]、氣相色譜-質譜聯用[12-13]、氣相色譜-二級質譜聯用[14]、液相色譜-質譜聯用[15]，由于超高效液相色譜-質譜串聯儀為實驗室常配儀器，根據歐盟委員會2002/657/EC決議的“四分法原則”，超高效液相色譜-質譜串聯法選取一個母離子和兩個子離子可得到較好的定性，同時該方法也是常用的定量方法，經方法適用性考察后，該方法的定性與定量效果也能滿足日常使用要求，且該方法的檢出限與定量限設定遠低于鉤吻堿和鉤吻堿子的經口攝入中毒劑量，能滿足食品中鉤吻堿和鉤吻堿子的常量與痕量分析，超高效液相色譜-質譜串聯法在準確度、靈敏度、檢測速度均優于上述多種方法，更適合斷腸草中毒的應急檢驗。經優化，最終選用試樣經1%鹽酸超聲提取，經MCX柱凈化后，運用超高效液相色譜-質譜串聯法對食品中鉤吻堿和鉤吻堿子進行定性和定量測定。