水產品中甲基汞檢測方法的優化與討論

余蘭，王洋怡舟

上海市營養食品質量監督檢驗站/上海源本食品質量檢驗有限公司（上海 200082）

自古而來便有“民以食為天”一說，雖然人們現如今生活和以往已發生了許多改變，然而對于飲食的關注仍是十分注重的。當下人們不僅僅只滿足于飽腹，對于飲食更加關注于它的安全性和健康性。相較于健康，安全性是食品最基本的要求。甲基汞作為全球性環境污染物，其危害可見一斑。隨著工農業的快速發展，它們排放的廢水會在一定條件下轉化為劇毒甲基汞，如汞礦冶煉排放含汞的廢水，會使土壤受到一定程度的污染，最終轉移到水體中，在微生物的作用下可轉化為甲基汞，通過食物鏈的富集，使魚、蝦、蟹、貝殼體內的甲基汞濃度超標，人們因食用被污染的魚、蝦、蟹、貝殼等而造成中毒；有機汞農藥的使用，在生產運輸過程中如果密封不嚴，就會造成大氣、水體、土壤污染。

目前，含有甲基汞的樣品根據載體的不同，有著不同的前處理方式，一般有衍生化、酸提取消解、富集等，再使用聯用技術來檢測水產品中的形態汞，主要有氣相色譜-電感耦合等離子體質譜（GC-ICPMS）法[1]、高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜（HPLC-ICP-MS）法[2]、高效液相色譜-原子熒光光譜（HPLC-AFS）[3-4]法等。GB 5009.17—2014《食品中總汞和有機汞的測定》[5]中使用的檢測技術是液相熒光聯用，但高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜法的靈敏度要比高效液相色譜-原子熒光光譜法要高，分離能力更強。雖然儀器價格比較昂貴，一般檢測行業會控制成本不會使用，但相信隨著ICP-MS儀器發展的國產化、技術的成熟化，分離速度快及性能優越的HPLC-ICP-MS定會成為檢測行業最先選擇的分析方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀、Agilent 1260-Agilent 7900電感耦合等離子體質譜儀（配有四極桿碰撞/反應池和MassHunter，工作站美國Agilent公司產品）；色譜柱：C18反相高效液相色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm，Agela Technologies Venusil）；C18反相高效液相色譜柱預柱（4.6 mm×10 mm，Agela）及C18反相高效液相色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，Agela Technologies Venusil）；BSA423S電子天平（OHAUS奧豪斯公司）；純水儀（上海和泰儀器公司）。

甲醇（CH3OH，色譜純）；氨水（NH3，25%）；L-半胱氨酸（L-HSCH2CH（NH2）COOH）；乙酸銨（CH3COONH4）；調諧液（Ce、Y、Li、Mg、Tl、Co質量濃度均為1 μg/L，美國Agilent公司產品）；硝酸（HNO3）、鹽酸（HCl）：優級純，國藥集團化學試劑有限公司。所有樣品的制備和配制標準溶液所用水均為超純水，電阻率＞18 MΩ·cm。

氯化汞標準儲備液（10 μg/mL，以Hg計）。甲基汞標準儲備液（200 μg/mL，以Hg計）：準確稱取0.025 g氯化甲基汞，定容至100 mL（用甲醇水溶液）。保存條件為4 ℃（避光保存），有效期為6個月。

以上兩個標準溶液配制成濃度均為1.00 μg/mL的混合標準溶液（以Hg計），用流動相稀釋。現用現配。

1.2 儀器工作條件

ICP-MS條件：RF發射功率1 550 W；采樣深度10.0 mm；霧化器1.04 L/min；蠕動泵轉速0.30 r/s；霧化室溫度2 ℃；載氣液氬；載氣流量0.55 L/min；輔助氣流量0.45 L/min；檢測質量數202Hg。

1.3 樣品前處理

稱取0.50～1.5 g（精確至0.001 g）樣品，再準確移取10 mL的5 mol/L鹽酸溶液，置于50 mL帶蓋塑料離心管中，渦旋后，放置過夜。室溫下振蕩超聲水浴（水浴溫度不可過高）提取60 min。以8 000 r/min轉速離心15 min。從離心管中準確吸取2.0 mL所需樣品的上清液，在冷水浴中緩慢滴加氨水（NH3·H2O），調節樣品溶液的pH 3～7（避免堿性條件下汞發生水解）。再加入0.2 mL 10 g/L的L-半胱氨酸溶液，用水定容至10 mL。用0.45 μm有機系濾膜過濾，待測。同時做空白試驗。

2 結果與討論

2.1 色譜分離優化

提出下列方法進行甲基汞單標的試驗分析

色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），進樣量100 μL，流速1.0 mL/min。流動相A為0.01 mol/L乙酸銨+0.3% L-半胱氨酸（pH 7.5），流動相B為甲醇，V（流動相A）∶V（流動相B）=95∶5。結果見圖1。

通過突破上述關鍵技術，研制設計了內筒超前底噴單動雙管鉆具(型號：TK-NCC01，以下用型號簡稱)，結構如圖5所示。

圖1 1.0 ng/mL質量濃度的甲基汞色譜圖

色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），進樣量100 μL，流速1.0 mL/min。流動相A為0.01 mol/L乙酸銨+0.3% L-半胱氨酸，流動相B為甲醇，V（流動相A）∶V（流動相B）=95∶5。結果見圖2。

再進行甲基汞和無機汞混合標準溶液的試驗分析。

色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），進樣量100 μL，流速1.0 mL/min。流動相A為0.01 mol/L乙酸銨+0.3% L-半胱氨酸，流動相B為甲醇，V（流動相A）∶V（流動相B）=95∶5。結果見圖3。

圖2 2.0 ng/mL質量濃度的甲基汞色譜圖

圖3 1.0 ng/mL質量濃度的無機汞和甲基汞混標色譜圖

色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），進樣量100 μL，流速1.0 mL/min。流動相A為0.01 mol/L乙酸銨+0.3% L-半胱氨酸（pH 3.0），流動相B為甲醇，V（流動相A）∶V（流動相B）=95∶5。結果見圖4。

圖4 2.0 ng/mL質量濃度的無機汞和甲基汞混標色譜圖

色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），進樣量100 μL，流速1.0 mL/min。流動相A為0.01 mol/L乙酸銨+0.3% L-半胱氨酸（pH 3.0），流動相B為甲醇，V（流動相A）∶V（流動相B）=97∶3。結果見圖5。

圖5 4.0 ng/mL質量濃度的無機汞和甲基汞混標色譜圖

色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），進樣量100 μL，流速1.0 mL/min。流動相A為0.01 mol/L乙酸銨+0.3% L-半胱氨酸調節（pH 3.0），流動相B為甲醇，V（流動相A）∶V（流動相B）=97∶3。結果見圖6。

圖6 6.0 ng/mL質量濃度的無機汞和甲基汞混標色譜圖

2.2 pH、流動相以及色譜柱的選擇

圖1顯示，當流動相pH為7.5時，甲基汞目標峰之前1.5 min左右出現倒峰，此色譜條件不利于混合標準溶液的測定。圖2顯示，在不調節pH的條件下，甲基汞目標峰出峰正常，沒有出現倒峰的情況。在圖2的條件下進行甲基汞和無機汞混合標準溶液的測定，圖3顯示甲基汞和無機汞存在峰嚴重重疊且無法完全分離的現象。改變pH，在酸性條件下進行測定，圖4顯示甲基汞和無機汞未完全分離，分離度不好。再改變流動相比例，減少有機相甲醇的比例，圖5顯示甲基汞和無機汞的分離度雖然有所改善，但也未能完全分離。改變色譜柱的長度，150 mm色譜柱更換為250 mm色譜柱，圖6顯示甲基汞和無機汞兩者完全分離，且峰型良好。GB 5009.17—2014和一些文獻中所用的色譜柱都是150 mm，但通過試驗不能完全把甲基汞和無機汞分離，所以把色譜柱換為250 mm，兩者分離度良好。故最終選擇色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、pH 3.0、流動相比例97∶3為高效液相色譜儀的最佳工作條件。

2.3 標準曲線、檢出限及線性方程

在各優化的條件下，分別準確吸取0.00，0.010，0.020，0.040，0.060和0.10 mL 1.00 μg/mL混合標準使用液，用流動相稀釋至刻度。故此標準系列溶液的質量濃度分別為0.0，1.0，2.0，4.0，6.0和10.0 ng/mL，經高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜測定，繪制標準曲線，結果見圖7。

圖7 無機汞和甲基汞標準工作曲線

以3倍信噪比（S/N=3）、10倍信噪比（S/N=10）計算方法檢出限與定量限。結果表明，在1～10 ng/mL范圍內濃度與峰面積呈線性關系，其線性方程、相關系數及檢出限見表1。

表1 甲基汞檢出限、定量限及線性方程

2.4 回收率與精密度

選取4種水產樣品，按8.0，24和80 μg/kg 3個水平添加甲基汞，按優化的前處理方法進行提取和測定，結果見圖8，圖9和表2。結果表明，測得的平均回收率范圍為80.8%～100%，RSD在0.80%～4.55%之間。

圖8 魷魚色譜圖

圖9 皮皮蝦色譜圖

表2 添加回收率和精密度（n=6）

3 結論

選擇C18反相高效液相色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），進樣量100 μL，流速1.0 mL/min；流動相A為0.01 mmol/L乙酸銨+0.3% L-半胱氨酸（pH 3.0），流動相B為甲醇，V（流動相A）∶V（流動相B）=97∶3為優化后的高效液相色譜法檢測條件。

在該優化方法的條件下，此次試驗對該優化方法的準確性、穩定性以及可靠性進行了評估。試驗結果顯示，無機汞和甲基汞的標準線性相關系數大于0.999 8；檢出限為0.9 μg/kg；在加標回收率方面，不同基質不同濃度的加標回收率滿足標準的要求，均值在80.8%～100%之間，相對標準偏RSD為0.80%～4.55%（n=6），小于5%。

試驗表明，優化方案所得的甲基汞檢測方法在分析樣品回收率等方面完全符合標準，是實驗室中檢測水產品及制品中甲基汞的一個可靠且可行的方法。