ε-聚賴氨酸豌豆蛋白抗菌膜制備及其性能

郭永

黃河水利職業技術學院環境工程學院（開封 475003）

豌豆蛋白是一種優質的植物蛋白，它營養豐富、來源廣泛、價格低廉而且不含植物激素和致敏源[1]，利用豌豆蛋白較好的成膜性制備的蛋白膜，能夠作為接觸包裝材料用于食品保鮮或直接食用，并且具有可生物降解性，能有效地解決塑料包裝廢棄物污染環境的問題，是將來食品包裝領域理想的新型材料[2]。但可食性膜因本身營養豐富，易受微生物污染，故可通過向膜中加入抑菌劑保證食品的品質。目前，安全、高效、穩定的可食性抑菌膜已經成為食品工業研究的熱點。

ε-聚賴氨酸（ε-poly-L-lysine，ε-PL）作為新型天然防腐劑，具有很好的殺菌能力和熱穩定性，日益受到食品保鮮應用領域的重視[3-4]。ε-PL由一類白色鏈霉菌（Streptomyces albulus）代謝產生，是一種具有廣譜抑菌性的多肽，由25～35個L-賴氨酸殘基組成，ε-PL能在人體內分解為賴氨酸，因此又是一種營養型抑菌劑，安全性高于其他化學防腐劑[5-6]。ε-PL由日本學者20世紀80年代初次發現，目前已發展比較成熟，在我國剛剛起步。近年來，國內文獻報道中利用ε-PL添加到抑菌膜較多，基質以殼聚糖、海藻酸鈉、阿拉伯膠、豌豆淀粉等多糖類為主[7-9]，蛋白類膜主要利用大豆分離蛋白作基質研究[10]，但鮮見ε-聚賴氨酸在豌豆蛋白可食性膜的應用研究。

此次試驗以豌豆為原料，經堿溶酸沉法得到豌豆分離蛋白，采用單因素試驗和正交試驗確定制備豌豆蛋白膜的最佳工藝參數，最終得到機械性能較好的豌豆蛋白膜，在其中添加抑菌性良好的ε-聚賴氨酸（ε-PL）制備抑菌蛋白膜，并研究ε-聚賴氨酸對蛋白膜理化性能的影響，為ε-PL抗菌膜的實際應用提供理論依據。

1 試驗材料與試劑

豌豆（市售）；ε-聚賴氨酸（甘油酯制劑，鄭州拜納佛生物工程股份有限公司）；正己烷（沈陽化學試劑廠）；甘油（國藥集團化學試劑有限公司）；蜂蠟（河北東光縣瑞豐蠟業有限公司）。

2 主要試驗儀器與設備

HH-6電熱恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）；PHS-3C型精密pH計（上海理達儀器廠）；旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；FD-5型真空冷凍干燥機（北京博醫康技術公司）；正方形玻璃板（自制）；螺旋測微器（蘇州量子儀器有限公司）。

3 試驗設計

3.1 脫脂豌豆粕的制備

取適量豌豆置于玻璃器皿，在40 ℃下在電熱恒溫鼓風干燥箱中烘干至恒質量[11]。再用高速多功能粉碎機研磨成粉，將磨好的豌豆粉與正己烷按1∶8（g/mL）比例混合，使正己烷和豌豆粉充分混勻，靜置于通風櫥內24 h，生成豌豆粉正己烷浸提液，然后用布氏抽濾器處理，得到低變性脫脂豌豆粕，備用，同時利用旋轉蒸發儀回收正己烷。

3.2 豌豆分離蛋白的提取

參照Stone等[12]堿溶酸沉的方法提取豌豆分離蛋白。利用堿溶酸沉法提取豌豆分離蛋白。將脫脂豌豆粕按1∶20（g/mL）溶于蒸餾水，配制成一定濃度溶液，用1.0 mol/L NaOH溶液調節pH至8.0，冷卻至室溫后在4 ℃下，以10 000 r/min離心30 min；取上清液，用1.0 mol/L HCl調pH至4.5，以10 000 r/min離心30 min。取沉淀，即得到豌豆分離蛋白（PPI），冷凍干燥，備用。

3.3 豌豆蛋白抑菌膜的制備

以膜的抗拉伸強度為考察指標，確定單因素豌豆蛋白濃度、pH、甘油添加量、蜂蠟、加熱溫度及加熱時間對豌豆蛋白膜機械性能的影響。在單因素試驗基礎上，采用正交試驗，確定最佳抗拉伸強度豌豆蛋白抑菌膜制備優化工藝條件。配制7.0%豌豆分離蛋膜液，調節成膜液pH至9.0，于90 ℃水浴30 min，得到成膜液。加入不同濃度的ε-聚賴氨酸，混勻后攪拌30 min，加入3 g/L蜂蠟、1%甘油。過濾后，脫氣除去表面氣泡。將50 mL濾液涂布于自制的玻璃板上，在60℃干燥4 h后揭膜，即得到豌豆蛋白抑菌膜，并在35℃和RH 55%的環境中平衡48 h，分別對膜進行物理功能和抑菌測定。

4 試驗分析方法

4.1 膜厚度的測定

膜厚度參照GB/T 6672—2001《塑料薄膜和薄片厚度機械測量法》[13]，使用螺旋測微器在膜上隨機選取10個點并計算其平均值。

4.2 機械性能的測定

機械性能參照GB/T 1041.1—2018/ISO 527-1：2012《塑料拉伸性能的測定》[14]，每個樣品測定3次，求平均值。

4.3 水蒸氣透過率的測定

水蒸氣透過率（Water vapor transmission rate of pea protein membrane，WVP）參照GB 1037—1988進行測定[15]。

4.4 蛋白膜水溶性的測定

蛋白膜水溶性參照Peng等[16]的方法并稍作改進。將膜樣品裁成20 mm×20 mm的正方形，烘干至恒質量，放入含有30 mL蒸餾水的100 mL錐形瓶中，在25℃恒溫振蕩箱中處理24 h，將不溶性膜樣品取出干燥至恒質量。每個樣品測定3次，求平均值。按式（1）計算膜的水溶性。

式中：m1為初始質量，g；m2為24 h后干燥平衡后的剩余質量，g。

式中：m1為初始質量，g；m3為浸泡后的膜樣品的質量，g。

5 結果與分析

5.1 ε-聚賴氨酸添加量對豌豆蛋白膜厚度的影響

由表1可知，未添加抑菌物質的對照膜厚度為200.55 μm。隨著ε-聚賴氨酸添加量的增加，膜的厚度有增加趨勢，當ε-聚賴氨酸添加量達0.3%時，膜的厚度增加并不顯著（p＞0.05）?？赡苁铅?聚賴氨酸的添加增加了蛋白膜中的干物質含量，而且ε-聚賴氨酸中的部分ɑ-氨基與蛋白質間的相互作用可能會在一定程度上改變膜的結構，導致膜的厚度有所增加，但不顯著。

表1 ε-聚賴氨酸對豌豆蛋白膜厚度的影響

5.2 ε-聚賴氨酸添加量對豌豆蛋白膜機械性能的影響

由表2可知，對照膜的抗拉伸強度為4.51 MPa，斷裂伸長率為128.48%。當ε-聚賴氨酸的添加量為0.5%時，蛋白膜的抗拉伸強度顯著提高（p＜0.05），比對照提高50.1%，斷裂伸長率提高17.3%?？赡苡捎讦?聚賴氨酸的膠體網絡交聯性質[17]，ε-聚賴氨酸分子上的部分ɑ-氨基與豌豆蛋白質羧基分子間的相互作用，電荷重新分布，形成的肽鍵使膜內分子結合更加緊密，導致膜的抗拉伸強度和斷裂伸長率提高。

5.3 ε-聚賴氨酸添加量對豌豆蛋白膜水蒸氣透過率的影響

由表3可知，當ε-聚賴氨酸添加量為0.5%時，隨著添加量的增加，膜的WVP比對照降低了35%，這可能是ε-聚賴氨酸與豌豆蛋白分子形成肽鍵，以及蜂蠟疏水基與蛋白質疏水基相互作用[18]，使膠體網絡緊密，降低了水蒸氣的透過性。WVP顯著降低，增強了抑菌膜的阻隔性，使其阻水性和隔氧性的實際應用效果更好。

表2 ε-聚賴氨酸對豌豆蛋白膜機械性能的影響

表3 ε-聚賴氨酸對豌豆蛋白膜水蒸氣透過率的影響

5.4 ε-聚賴氨酸添加量對豌豆蛋白膜水溶性的影響

由表4可知，隨著ε-聚賴氨酸添加量的增加，蛋白膜的溶解度和溶脹指數分別降低了22.3%和34.0%。當ε-聚賴氨酸的添加量為0.7%時，蛋白膜的溶解度和溶脹指數最?。╬＜0.05）?？赡苁铅?PL弱極性分子與豌豆蛋白分子相互作用，形成的膜分子間結合更加緊密，減少了聚合物基質的自由體積，降低了蛋白膜水溶性。

表4 ε-聚賴氨酸對豌豆蛋白膜水溶性的影響

5.5 ε-聚賴氨酸添加量對豌豆蛋白膜抑菌性的影響

從表5可看出，當ε-聚賴氨酸的添加量不超過0.5%時，蛋白膜對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌沒有抑制作用；當ε-聚賴氨酸的添加量達到0.5%時，蛋白膜對兩種菌株均有抑制作用，且隨著ε-聚賴氨酸添加量的增加，抑菌圈直徑顯著增大（p＜0.05）。這可能是ε-聚賴氨酸呈高聚合多價陽離子態，具有表面活性劑作用，破壞了細菌的細胞膜結構，引起細胞物質、能量和信息中斷，從而導致細胞死亡，故發揮抑菌作用[19]?？紤]到應用的經濟性，選擇0.5%即可達到良好的抑菌效果。

表5 ε-聚賴氨酸對豌豆蛋白膜抑菌性的影響

6 結論

以豌豆蛋白為基質的成膜液中添加0.5%的ε-聚賴氨酸抑菌劑，所制備的抑菌膜不僅對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌產生明顯的抑菌作用，而且由于自身的交聯性，膜的結構更加緊密，提高了豌豆蛋白膜抗拉強度和韌性，降低了水蒸氣透過性和水溶性，總體改善了豌豆蛋白膜的物理性能，安全而環保，因此，在食品保鮮領域應用前景廣闊。