酵母雙雜交系統(tǒng)在本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的應(yīng)用

周敬偉，付涵予，李萌萌，劉英奎，劉 永

（徐州醫(yī)科大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，江蘇 徐州 221004）

隨著人類基因組計(jì)劃的完成，生命科學(xué)的研究已進(jìn)入功能基因組時(shí)代，而如何對(duì)大規(guī)模測(cè)序計(jì)劃揭示的基因進(jìn)行功能注釋是目前我們面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)[1]。通過(guò)識(shí)別蛋白質(zhì)之間的相互作用是理解它們功能的一個(gè)重要途徑，酵母雙雜交系統(tǒng)（yeast two-hybrid system，Y2H）是目前鑒定體內(nèi)蛋白相互作用最有效、最廣泛的一種技術(shù)。同其他技術(shù)相比，它具有真實(shí)性、高靈敏度、低成本、易操作等優(yōu)點(diǎn)[2-4]。目前該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于多個(gè)研究領(lǐng)域，包括篩選新蛋白的相互作用、建立基因組蛋白連鎖圖和鑒定蛋白相互作用的結(jié)構(gòu)域等[5-8]。

1 酵母雙雜交系統(tǒng)的基本原理

酵母雙雜交系統(tǒng)最初是由Stanley Fields[9]等人在1989年建立，其基本原理是轉(zhuǎn)錄激活因子可以和基因上游的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)結(jié)合而啟動(dòng)相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄激活因子由兩個(gè)相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域即 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（binding domain，BD）和轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域（activation domain，AD）組成，并且這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域只有相互靠近結(jié)合才能激活相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄[10]。在雙雜交系統(tǒng)中，DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域通常與已知蛋白（又稱誘餌蛋白）融合，轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域與文庫(kù)蛋白或需驗(yàn)證的蛋白（又稱獵物蛋白）相結(jié)合。當(dāng)誘餌和獵物融合蛋白共同表達(dá)于同一酵母細(xì)胞中，如果誘餌蛋白和獵物蛋白相互作用，則轉(zhuǎn)錄激活因子得以重組，從而激活報(bào)告基因。因此，只有表達(dá)報(bào)告基因的酵母細(xì)胞才允許在篩選培養(yǎng)基上生長(zhǎng)[4]。

目前，高等院校的實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容仍以基本實(shí)驗(yàn)為主，學(xué)生學(xué)習(xí)的積極主動(dòng)性較差，也不利于學(xué)生綜合科研能力的培養(yǎng)[11]。我院生物技術(shù)教研室設(shè)計(jì)了一項(xiàng)綜合性實(shí)驗(yàn)——利用酵母雙雜交系統(tǒng)驗(yàn)證 HIF-1α與Jab1的相互作用。低氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1α）是細(xì)胞內(nèi)感受氧濃度并調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)缺氧產(chǎn)生適用性反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子，已有文獻(xiàn)報(bào)道Jab1可與HIF-1α結(jié)合來(lái)調(diào)控其活性[12-13]。

2 實(shí)驗(yàn)儀器、實(shí)驗(yàn)材料與試劑

實(shí)驗(yàn)儀器包括：分光光度計(jì)，高速冷凍離心機(jī)，水浴鍋，旋渦儀，恒溫振蕩培養(yǎng)箱，恒溫培養(yǎng)箱，免疫印跡相關(guān)儀器等。

實(shí)驗(yàn)材料與試劑包括：相關(guān)質(zhì)粒（pGBKT7、pGADT7、pGBKT7-HIF-1α 和 pGADT7-Jab1），Y2HGold酵母，酵母轉(zhuǎn)化試劑盒，YPDA培養(yǎng)基，SD base，-Leu，-Trp，-Leu/-Trp，X-a-Gal，Aureobasidin A（AbA），Agar，HIF-1α和Jab1抗體等。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 檢測(cè)HIF-1α和Jab1在酵母中的表達(dá)

本實(shí)驗(yàn)所用質(zhì)粒分別為 pGBKT7、pGADT7、pGBKT7-HIF-1α和pGADT7-Jab1。將上述質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，并用分光光度計(jì)測(cè)定相關(guān)質(zhì)粒的濃度，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.1.1 酵母細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化

酵母細(xì)胞的制備步驟如下：

（1）從YPDA固體培養(yǎng)皿上挑取直徑2～3 mm的Y2HGold酵母單菌落，接種到5 mL YPDA液體培養(yǎng)基中，30 ℃、250 rpm培養(yǎng)8～12 h。

（2）吸取上述菌液5 μL接種到50 mL YPDA液體培養(yǎng)基中，250 rpm培養(yǎng)16～24 h，使OD600值在0.15～0.3之間。

（3）將菌液倒入50 mL無(wú)菌離心管中，室溫700 g離心5 min。

（4）棄上清，再用100 mL YPDA液體培養(yǎng)基重懸菌體，250 rpm 培養(yǎng) 3～5 h，使 OD600值在 0.4～0.5之間。

（5）將菌液平分到兩個(gè)50 mL無(wú)菌離心管中，室溫下700 g離心5 min。棄上清，再用30 mL無(wú)菌水重懸菌體。

（6）室溫下700 g離心5 min。棄上清，加入1.5 mL 1.1×TE/LiAc（1.1倍體積的 TE緩沖液和醋酸鋰等比例混合液）重懸菌體，再轉(zhuǎn)移至兩個(gè)1.5 mL無(wú)菌離心管中，高速室溫離心15 s。

（7）棄上清，每管加入600 μL 1.1×TE/LiAc重懸菌體，置于冰上保溫，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化步驟如下：

（1）取上述酵母細(xì)胞50 μL至1.5 mL無(wú)菌離心管中，加入100 ng質(zhì)粒（pGBKT7、pGADT7、pGBKT7-HIF-1α和 pGADT7-Jab1）及 5 μL鮭魚(yú)精DNA，移液槍輕輕吸打混勻。

（2）加入500 μL PEG/LiAc溶液，輕輕混勻。

（3）30 ℃孵育30 min，每隔10 min輕輕混勻一次。

（4）加入20 μL DMSO，輕輕混勻。

（5）42 ℃水浴熱擊15 min，每隔5 min輕輕混勻一次。

（6）高速室溫離心15 s。

（7）棄上清，加入1 mL 0.9 % (w/v) NaCl溶液重懸菌體，吸取適量菌液涂布在相應(yīng)的 SD篩選培養(yǎng)基上，30 ℃倒置培養(yǎng)3～5天。

3.1.2 酵母蛋白的提取

酵母蛋白的提取步驟如下：

（1）從 SD篩選固體培養(yǎng)皿上挑取直徑 1～2 mm的Y2HGold酵母單菌落，接種到5 mL SD篩選液體培養(yǎng)基中，30 ℃、250 rpm過(guò)夜培養(yǎng)。

（2）將上述菌液高速旋渦0.5～1 min，再全部轉(zhuǎn)移到50 mL YPDA液體培養(yǎng)基中，250 rpm培養(yǎng)至OD600值在0.4～0.6之間。

（3）將菌液倒入 50 mL提前預(yù)冷的離心管中，4 ℃、1000 g離心 5 min。

（4）棄上清，用50 mL預(yù)冷的無(wú)菌水重懸菌體，4 ℃、1000 g離心5 min，棄上清，菌體-70 ℃保存。

（5）每7.5 OD600單位的細(xì)胞加入60 ℃提前預(yù)熱的裂解液100 μL。

（6）重懸細(xì)胞，再轉(zhuǎn)移至1.5 mL無(wú)菌離心管中。每7.5 OD600單位的細(xì)胞加入80 μL玻璃珠。

（7）70 ℃水浴保溫 10 min，高速旋渦 1 min，4 ℃、14 000 g離心5 min，上清轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中。

（8）沉淀于100 ℃水浴加熱3～5 min，高速旋渦1 min，4 ℃、14 000 g離心5 min，上清轉(zhuǎn)移至上一步的上清中。

（9）加入4 × loading buffer（4倍體積的蛋白質(zhì)上樣緩沖液），92～95 ℃水浴5 min，-20 ℃保存。

3.1.3 免疫印跡

用于檢測(cè)蛋白質(zhì)的表達(dá)，參照 ActaPharmacolSin等學(xué)者的方法（ActaPharmacolSin, 2000, 21:695-700）。

3.2 HIF-1α和Jab1在酵母中的自激活及毒性檢測(cè)

3.2.1 自激活檢測(cè)

將100 ng的質(zhì)粒pGBKT7-HIF-1α轉(zhuǎn)入Y2HGold酵母細(xì)胞中，取適量菌液分別涂于SD/-Trp、SD/-Trp/X-a-Gal和SD/-Trp/X-a-Gal/AbA固體培養(yǎng)基上；將轉(zhuǎn)入質(zhì)粒 pGADT7-Jab1酵母細(xì)胞取適量菌液分別涂于SD/-Leu、SD/-Leu/X-a-Gal和 SD/-Leu/X-a-Gal/AbA固體培養(yǎng)基上，30 ℃倒置培養(yǎng) 3～5天，觀察菌落生長(zhǎng)狀況。

3.2.2 毒性檢測(cè)

1）根據(jù)酵母形態(tài)檢測(cè)其毒性。

將100 ng的質(zhì)粒pGBKT7、pGBKT7-HIF-1α轉(zhuǎn)入Y2HGold酵母細(xì)胞中，取適量菌液涂于SD/-Trp固體培養(yǎng)基上；將轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pGADT7、pGADT7-Jab1酵母細(xì)胞取適量菌液涂于SD/-Leu固體培養(yǎng)基上，30°C倒置培養(yǎng)3～5天，觀察菌落大小。

2）根據(jù)酵母生長(zhǎng)曲線檢測(cè)其毒性。

（1）從SD篩選固體培養(yǎng)皿上挑取直徑1 ～ 2 mm的 Y2HGold酵母單菌落（分別轉(zhuǎn)有質(zhì)粒 pGBKT7、pGADT7、pGBKT7-HIF-1α 和 pGADT7-Jab1），接種到5 mL合適的SD篩選液體培養(yǎng)基中，30 ℃、250 rpm過(guò)夜培養(yǎng)。

（2）吸取適量菌液接種到50 mL SD篩選液體培養(yǎng)基中，使其OD600= 0.1，30 ℃、250 rpm培養(yǎng)，利用分光光度計(jì)于600 nm處在第1、3、5、7、9 h測(cè)定其吸光度。

3.3 HIF-1α與Jab1相互作用的檢測(cè)

分別將實(shí)驗(yàn)組（pGBKT7-HIF-1α和 pGADT7-Jab1）、陽(yáng)性對(duì)照組（pGBKT7-53和 pGADT7-T）和陰性對(duì)照組（pGBKT7-LAM 和 pGADT7-T）的質(zhì)粒（100 ng）轉(zhuǎn)入Y2HGold酵母細(xì)胞中。取適量菌液涂于 SD/-Leu、SD/-Trp、SD/-Leu/-Trp和 SD/-Leu/-Trp/X-a-Gal/AbA（DDO/X/A）固體培養(yǎng)基上，30 ℃倒置培養(yǎng)3～5天，觀察菌落生長(zhǎng)狀況。

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.1 HIF-1α和Jab1在酵母中正常表達(dá)

首先將質(zhì)粒 pGBKT7、pGADT7、pGBKT7-HIF-1α、pGADT7-Jab1分別轉(zhuǎn)至酵母表達(dá)菌株Y2HGold，涂于相應(yīng)的 SD篩選培養(yǎng)基中，挑出單菌落振蕩培養(yǎng)，提取酵母蛋白；再利用免疫印跡技術(shù)檢測(cè)HIF-1α、Jab1蛋白表達(dá)。如圖 1所示，在轉(zhuǎn)入 pGBKT7-HIF-1α、pGADT7-Jab1的酵母中能檢測(cè)到 HIF-1α、Jab1的表達(dá)，且蛋白大小與預(yù)期一致。該結(jié)果表明HIF-1α、Jab1在酵母Y2HGold中都能正常表達(dá)。

圖1 HIF-1α和Jab1在酵母中的蛋白表達(dá)檢測(cè)

4.2 HIF-1α和Jab1在酵母中不存在自激活現(xiàn)象

將pGBKT7-HIF-1α轉(zhuǎn)入Y2HGold酵母中，分別涂于 SD/-Trp、SD/-Trp/X-a-Gal和 SD/-Trp/X-a-Gal/AbA培養(yǎng)基上，將轉(zhuǎn)入 pGADT7-Jab1酵母分別涂于SD/-Leu、SD/-Leu/X-a-Gal和 SD/-Leu/X-a-Gal/AbA培養(yǎng)基上，30 ℃倒置培養(yǎng)，觀察酵母生長(zhǎng)情況，結(jié)果如圖 2所示。酵母在 SD/-Trp/X-a-Gal或 SD/-Leu/X-a-Gal培養(yǎng)基上能夠生長(zhǎng)且不變藍(lán)，而在 SD/-Trp/X-a-Gal/AbA或 SD/-Leu/X-a-Gal/AbA培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)，表明HIF-1α和Jab1在酵母中不存在自激活現(xiàn)象。

圖2 HIF-1α和Jab1自激活檢測(cè)

4.3 HIF-1α和Jab1對(duì)酵母無(wú)毒性

將含 pGBKT7、pGBKT7-HIF-1α酵母涂于 SD/-Trp培養(yǎng)基上，將轉(zhuǎn)入pGADT7、pGADT7-Jab1酵母涂于 SD/-Leu培養(yǎng)基上，30 ℃倒置培養(yǎng)，觀察比較酵母菌落的大小。如圖3所示，含pGBKT7、pGBKT7-HIF-1α酵母菌大小基本一致；含pGADT7、pGADT7-Jab1酵母菌大小也基本一致。將含有 pGBKT7、pGADT7、pGBKT7-HIF-1α和 pGADT7-Jab1的酵母菌接種到合適的SD篩選培養(yǎng)基中，30 ℃、250 rpm培養(yǎng)，利用分光光度計(jì)檢測(cè)酵母濃度。如圖4所示，轉(zhuǎn)染空載體和質(zhì)粒的酵母菌（含 pGBKT7、pGBKT7-HIF-1α、pGADT7、pGADT7-Jab1）生長(zhǎng)曲線基本一致。該結(jié)果表明，HIF-1α 和Jab1對(duì)酵母無(wú)毒性。

圖3 HIF-1α和Jab1毒性檢測(cè)

圖4 含HIF-1α和Jab1酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

4.4 HIF-1α與Jab1在酵母中的相互作用

將含有實(shí)驗(yàn)組、陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組的質(zhì)粒酵母分別涂于 SD/-Leu、SD/-Trp、SD/-Leu/-Trp和DDO/X/A培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)觀察酵母的生長(zhǎng)情況。如圖 5所示，陰性對(duì)照組（pGBKT7-LAM 和pGADT7-T）在SD/-Leu、SD/-Trp和SD/-Leu/-Trp培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)，在 DDO/X/A培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)操作無(wú)誤；實(shí)驗(yàn)組（pGBKT7-HIF-1α和pGADT7-Jab1）和陽(yáng)性對(duì)照組（pGBKT7-53和pGADT7-T）在SD/-Leu、SD/-Trp和SD/-Leu/-Trp培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)，并且其在 DDO/X/A培養(yǎng)基上也能正常生長(zhǎng)并變藍(lán)。該結(jié)果表明，HIF-1α與 Jab1在酵母中存在相互作用。

圖5 HIF-1α與Jab1在酵母中相互作用的驗(yàn)證

5 注意事項(xiàng)

（1）培養(yǎng)基的配制及使用。本實(shí)驗(yàn)所需培養(yǎng)基的種類較多，應(yīng)根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)要求選擇合適的培養(yǎng)基并正確配制試劑。首次進(jìn)行酵母菌液涂板實(shí)驗(yàn)時(shí)，一定要梯度稀釋菌液，從而選擇一個(gè)最佳的菌液涂板濃度，同時(shí)注意實(shí)驗(yàn)的無(wú)菌操作。

（2）外源基因在酵母中正常表達(dá)。在驗(yàn)證蛋白相互作用前，一定先檢測(cè)誘餌蛋白及獵物蛋白在酵母中是否正常表達(dá)，常用的檢測(cè)方法是分子水平的PCR檢測(cè)和蛋白水平的免疫印跡檢測(cè)。

（3）確保外源蛋白在酵母中無(wú)毒性及自激活。酵母雙雜交系統(tǒng)是以酵母細(xì)胞為載體的，因此必須首先檢測(cè)誘餌蛋白和獵物蛋白對(duì)酵母細(xì)胞的毒性及他們?cè)谠诮湍讣?xì)胞中有無(wú)自激活現(xiàn)象。只有保證外源蛋白對(duì)酵母細(xì)胞無(wú)毒性及自激活現(xiàn)象，才能進(jìn)行后續(xù)驗(yàn)證蛋白相互作用的實(shí)驗(yàn)。

（4）設(shè)置合理的陽(yáng)性對(duì)照及陰性對(duì)照。為了保證實(shí)驗(yàn)操作的可靠性，一定要設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照及陰性對(duì)照。

6 實(shí)驗(yàn)安排及效果

本實(shí)驗(yàn)是一個(gè)綜合性實(shí)驗(yàn)，面向高年級(jí)具有一定分子生物學(xué)基礎(chǔ)的學(xué)生開(kāi)設(shè)。實(shí)驗(yàn)安排以學(xué)生為主體，教師起輔導(dǎo)作用，給予學(xué)生更多的思考空間[14-15]。要求實(shí)驗(yàn)報(bào)告以科研論文的形式書(shū)寫(xiě)，培養(yǎng)學(xué)生的科研思維及撰寫(xiě)科研論文的能力。教學(xué)實(shí)踐表明，本實(shí)驗(yàn)科研應(yīng)用性強(qiáng)，結(jié)果較為直觀，有利于調(diào)動(dòng)學(xué)生的學(xué)習(xí)積極性。

7 結(jié)語(yǔ)

將科研中常用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)應(yīng)用于本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)，是教學(xué)改革的重要方向[16]。開(kāi)展“利用酵母雙雜交系統(tǒng)驗(yàn)證HIF-1α與Jab1相互作用”這一綜合性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，旨在將酵母雙雜交技術(shù)引入本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)，在提高學(xué)生學(xué)習(xí)積極性的同時(shí)，還有利于學(xué)生對(duì)該項(xiàng)技術(shù)的原理和操作要點(diǎn)的掌握，有利于學(xué)生科研思維及科研素養(yǎng)的培養(yǎng)，進(jìn)一步促進(jìn)了教學(xué)與科研的相互融合。