豬尿中四種磺胺藥物殘留檢測(cè)試劑盒效能評(píng)估

王 博 曹向英 孫文梅 張 婧 黃 忠 施蔡培

（1、上海市獸藥飼料檢測(cè)所,上海201103 2、上海市松江區(qū)食用農(nóng)產(chǎn)品安全監(jiān)督檢測(cè)中心，上海201611 3、上海市嘉定區(qū)農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)中心, 上海201800 4、上海市崇明區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,上海202150)

磺胺類藥物是一類人工合成的抗生素，因其抗菌譜較廣、性質(zhì)穩(wěn)定、價(jià)格便宜等原因被廣泛應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè)，但是通過(guò)動(dòng)物體內(nèi)殘留轉(zhuǎn)移到人體可能會(huì)引起過(guò)敏、中毒和導(dǎo)致耐藥性細(xì)菌的產(chǎn)生, 還可能引起造血系統(tǒng)障礙等問(wèn)題[1,2]。我國(guó)農(nóng)業(yè)部168號(hào)公告[3]中規(guī)定磺胺二甲嘧啶為允許用于防治動(dòng)物疾病，但僅是通過(guò)混飼給藥使用，且規(guī)定其休藥期為15 天。通過(guò)對(duì)豬屠宰前尿液檢測(cè)，能判斷養(yǎng)殖場(chǎng)或養(yǎng)殖戶是否按規(guī)定執(zhí)行休藥期，這對(duì)于食品安全來(lái)說(shuō)是非常有必要的。而隨著農(nóng)業(yè)農(nóng)村部194號(hào)公告[4]的發(fā)布，促生長(zhǎng)類抗生素不得使用，規(guī)范、綠色、健康化養(yǎng)殖是畜牧業(yè)發(fā)展的大趨勢(shì)，因此，對(duì)于非法添加的監(jiān)控措施愈發(fā)顯得重要。

目前國(guó)內(nèi)外檢測(cè)磺胺的方法多為液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜法[5,6]，其因檢測(cè)時(shí)間短、檢測(cè)限低、結(jié)果準(zhǔn)確、能大批量處理樣品而被廣泛應(yīng)用，但缺點(diǎn)是儀器成本高，難以滿足養(yǎng)殖業(yè)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和推廣使用，因此就需要一種快速、準(zhǔn)確、方便、易于推廣的篩查方法。Elisa 快速檢測(cè)試劑盒是一種比較適合快篩的工具[7,8]，其使用基礎(chǔ)在于抗原抗體之間的特異結(jié)合反應(yīng)，方法快速、準(zhǔn)確，和質(zhì)譜相比，快速檢測(cè)試劑盒成本低、易攜帶，能滿足實(shí)際檢測(cè)需求，更適合推廣。目前，市面上針對(duì)豬尿中磺胺類殘留的檢測(cè)試劑盒有多種，但是對(duì)于試劑盒實(shí)際檢測(cè)效果的評(píng)價(jià)卻沒(méi)有，這對(duì)于不同地區(qū)對(duì)豬尿中磺胺類藥物殘留監(jiān)管是不利的，本文通過(guò)考察常見(jiàn)的3 種市售磺胺檢測(cè)試劑盒，對(duì)3 種試劑盒的各方面效能進(jìn)行比較，挑選出最為適合日常檢測(cè)磺胺的檢測(cè)試劑盒，為各地加強(qiáng)監(jiān)管提供參考。本文暫將3 種試劑盒編為試劑盒1，試劑盒2，試劑盒3，其中試劑盒2 為深圳市綠詩(shī)源生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的磺胺多殘留快速檢測(cè)試劑盒。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器。BioTek 酶標(biāo)儀，美國(guó)伯騰儀器有限公司；BOD-10 低溫恒溫培養(yǎng)箱，賽默飛世爾科技(中國(guó)) 有限公司；Allegra X-22R 高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)BECKMAN 公司；N-EVAP 水浴控溫氮吹儀，上海安譜公司。

1.1.2 試劑與材料磺胺二甲 (基) 嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品，批號(hào):40730，99.0%，德國(guó)Dr. Ehrenstorfer 公司；磺胺氯噠嗪標(biāo)準(zhǔn)品，批號(hào): 20620，100.0%，德國(guó)Dr. Ehrenstorfer 公司；磺胺間甲氧嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品，批號(hào): 40425，98.0%，德國(guó)Dr. Ehrenstorfer 公司；磺胺嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品，批號(hào): 31010，99.0%，德國(guó)Dr. Ehrenstorfer 公司；磷酸氫二鈉，批號(hào)：20130719，99.0%，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；磷酸二氫鉀，批號(hào)：F20030220，99.5%，中國(guó)醫(yī)藥（集團(tuán)）上海化學(xué)試劑有限公司；氯化鈉，批號(hào)：20140712，99.5%，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 主要試液配制磷酸鹽緩沖液：準(zhǔn)確稱取磷酸氫二鈉0.77g、磷酸二氫鉀0.18g 和氯化鈉8.94g，用1000mL 超純水定容混勻，即制得磷酸鹽緩沖液。

1.2 前處理方法試劑盒1，試劑盒2：將樣品離心后，直接取50μL 進(jìn)行檢測(cè)。試劑盒3：將樣品均質(zhì)，取1mL 至試管中，加5mL 乙酸乙酯，混勻后上下顛倒15 分鐘，離心，取1mL 上清液至試管中，50℃條件下氮?dú)獯蹈桑褂?mL 磷酸緩沖液復(fù)溶，吸取100μL 復(fù)溶物至試管中，加入300μL 磷酸鹽緩沖液，取50μL 進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 檢測(cè)方法按照儀器及試劑盒說(shuō)明書(shū)，用配套校準(zhǔn)品對(duì)試劑盒進(jìn)行定標(biāo)，并按照說(shuō)明書(shū)方法對(duì)已處理好的樣品進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線由6 ～7 個(gè)濃度組成，重復(fù)點(diǎn)樣2次，按4 參數(shù)法進(jìn)行計(jì)算，以吸光度為橫坐標(biāo)，樣品濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)表1，三種試劑盒均表現(xiàn)出良好的線性相關(guān)性。

2.2 試劑盒靈敏度試劑盒的檢測(cè)靈敏度以標(biāo)準(zhǔn)曲線重復(fù)測(cè)定的50%抑制濃度IC50來(lái)表示，見(jiàn)表2，一般來(lái)說(shuō)，IC50數(shù)值越小說(shuō)明抗體的特異性能越強(qiáng)，如表2 所示，試劑盒3 抗體的特異性能最強(qiáng)，因豬尿中磺胺殘留限量并無(wú)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)作出規(guī)定，故參考GB 31650-2019 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中獸藥最大殘留限量中規(guī)定：所有食品動(dòng)物（產(chǎn)蛋期禁用）各靶組織中的最大殘留限量為100 μg/kg，因此，三種試劑盒均能滿足實(shí)際檢測(cè)需求。

2.3 回收率測(cè)定實(shí)驗(yàn)選擇較為常見(jiàn)的磺胺二甲基嘧啶、磺胺氯噠嗪、磺胺間甲氧嘧啶和磺胺嘧啶作為磺胺類混標(biāo)，通過(guò)向空白樣品中添加低中高三個(gè)不同濃度的磺胺類混標(biāo)來(lái)考察試劑盒的準(zhǔn)確性，每個(gè)濃度樣品重復(fù)5 次。因試劑盒1 標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍為0～40.5μg/L，因此試劑盒1 采取10、25 和40μg/L 三個(gè)濃度添加；試劑盒2 和3 則采用10、40 和100μg/L 三個(gè)濃度添加。陰性尿樣采自于上海市某豬場(chǎng)，經(jīng)LC-MS/MS 檢測(cè)無(wú)磺胺殘留，添加回收的檢測(cè)數(shù)據(jù)見(jiàn)表3，如表所示，試劑盒2 的回收率為88.2～125.1%，另外兩種試劑盒回收率分別為59.5～71.4%和56.4～73.1%，這可能是三種試劑盒對(duì)不同類磺胺的選擇性不同，結(jié)果表明，試劑盒2 對(duì)目標(biāo)磺胺類檢測(cè)結(jié)果更準(zhǔn)確。

表1 三種試劑盒線性范圍、標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性相關(guān)

表2 三種試劑盒的IC50 值（μg/L）

表3 三種試劑盒添加回收率實(shí)驗(yàn)（n=5）

2.4 實(shí)際樣品檢測(cè)與確證實(shí)驗(yàn)選取上海市某豬廠采集的20批豬尿樣品，用三種試劑盒進(jìn)行篩查，并對(duì)采集來(lái)的樣品用質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，樣品中均未檢測(cè)出磺胺。

2.5 操作步驟便捷程度此次實(shí)驗(yàn)針對(duì)豬尿液中磺胺進(jìn)行檢測(cè)，三種試劑盒均采用一步競(jìng)爭(zhēng)法，其檢測(cè)過(guò)程都包含了一步競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)和一步顯色反應(yīng)，但在具體操作上還是具有較大差別，其中試劑盒1 加樣4 次，孵育10 分鐘，顯色10 分鐘；試劑盒2 加樣5 次，孵育30 分鐘，顯色15 分鐘；兩類試劑盒規(guī)定樣品澄清均可直接加樣，操作簡(jiǎn)便；試劑盒3 加樣4 次，孵育1 小時(shí)，顯色30 分鐘，樣品前處理復(fù)雜，操作耗時(shí)耗力。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)市售的三種磺胺檢測(cè)試劑盒進(jìn)行評(píng)價(jià)，通過(guò)對(duì)試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線、靈敏度、回收率、實(shí)際樣品的檢測(cè)和操作步驟的便捷程度進(jìn)行考察，結(jié)果表明，試劑盒2，即深圳市綠詩(shī)源生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的磺胺多殘留快速檢測(cè)試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線、回收率和操作步驟明顯要好于另外兩種試劑盒，靈敏度也能滿足實(shí)際檢測(cè)需求，實(shí)際操作過(guò)程中，前處理簡(jiǎn)單，能有效避免因操作不當(dāng)帶來(lái)的誤差，因此，推薦其作為豬尿中磺胺殘留檢測(cè)的快篩試劑盒。