SLE-UPLC-MS/MS檢測血液中溴敵隆和大隆*

時巧翠，李曉飛，謝偉宏

(1 浙江警察學院刑事科學技術系，浙江 杭州 310053；2 杭州市公安局刑事科學技術研究所，浙江 杭州 310004)

我國是農業大國，滅鼠劑應用廣泛。因為毒性強，極易引起中毒，毒鼠強、氟乙酰胺等急性滅鼠藥逐漸被禁止使用。現在被廣泛使用的主要是抗凝血類的慢性殺鼠藥[1]。溴敵隆和大隆是目前使用較多的抗凝血殺鼠藥。由于溴敵隆和大隆比較容易獲得，近年來人、家畜等誤食中毒以及被用來投毒的情況時有發生。因此，建立一種快速檢測血液中溴敵隆和大隆的方法，既能使中毒者獲得對癥治療又可以為公安機關立案偵破及訴訟提供科學依據。

目前在法庭科學中廣泛應用的前處理方法主要有固相萃取、液液萃取等。這些前處理方法雖然成本較低，但存在操作繁瑣費時，常需要使用對人體和環境有毒害作用的有機溶劑且提取率較低。樣品前處理技術是能夠直接影響毒物檢出率的關鍵步驟[2]。Johnson于1997年提出一種新的樣品前處理技術，即介質液液萃取(supported liquid extraction，SLE)技術[3]。該技術操作簡便，基質干擾小，能大大縮短樣品的提取時間，提高樣品的回收率，并且在96孔板結構的高通量體系中也可以使用。在藥物分析[4]，食品安全，環境檢測及法庭科學等很多方面都有應用介質液液萃取技術的相關報道[5-6]。

目前，一般采用氣相色譜法[7]、液相色譜法[8]、氣質聯用法及液質聯用法[9-10]等來檢測生物撿材中的溴敵隆和大隆。本研究建立了SLE-UPLC-MS/MS(介質液液萃取-高效液相色譜-三重四級桿/復合線性離子阱質譜)檢測血液中溴敵隆和大隆的方法。該方法能夠快速有效地對血液樣品中的溴敵隆和大隆進行定性與定量分析且具有選擇性強、提取率高、 重現性好，檢測時間短等特點。

1 實 驗

1.1 試劑與儀器

高效液相色譜/質譜聯用儀(Shimazu LC 20A/AB Sciex Qtrap 6500)；介質液液萃取柱(Biotage ISOLUTE SLE 1 mL)。100 μg/mL的溴敵隆和大隆標準溶液，Accustandard公司。

緩沖溶液：pH為2的緩沖溶液由0.2 mol/L HCl溶液和0.2 mol/L KCl溶液按比例配制而成；用0.2 mol/L Na2HPO4溶液和0.2 mol/L NaH2PO4溶液按比例配制成pH為4和6的緩沖溶液；pH為7的緩沖溶液以飽和NaCl溶液代替。

甲酸、甲醇、乙腈均為色譜純。乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿均為分析純。

1.2 儀器工作條件

色譜條件：色譜柱為Kinetex C18(50 mm×3.0 mm，2.6 μm)；柱溫40 ℃；流速0.8 mL/min。流動相：A相為0.1%甲酸水溶液，B相為乙腈:甲醇=1:1(V:V)。梯度洗脫程序為：B相初始為10%，0.5 min升到90%，保持到3 min，3.1 min降到10%，一直保持到6 min，進樣量5 μL。

質譜條件：電噴霧離子源(ESI)；分析物在負離子模式下進行檢測；輔助加熱氣溫度為500 ℃；離子化電壓為-4500 V；壓力選擇Medium；噴霧氣壓力為50 psi；輔助加熱氣壓力為50 psi；多反應監測(MRM)；氣簾氣壓力為20 psi；碰撞氣為N2。主要質譜參數如表1所示。

表1 溴敵隆和大隆的質譜參數Table 1 Mass spectrometric parameters for bromoadiolone and brodifacoum

1.3 血液樣品的處理方法

在空白血液中加入一定量的溴敵隆和大隆，在振蕩器上振動30 s，使其混合均勻。用移液槍準確移取0.5 mL血樣，加入到0.3 mL 緩沖溶液(pH=2)中，振蕩器上振動30 s，混合混勻。將上述制備好的血液樣品加入到SLE柱中并施加一定的壓力，使樣品全部均勻分散在填料上。靜置2 min后，用流速為1 mL/min的洗脫液將其洗脫，并施加壓力將柱中殘余液體擠出。用氮氣將洗脫液吹干后，用初始流動相溶解并定容至1 mL，在上述選定的儀器工作條件下進行測定。

2 結果與討論

2.1 質譜條件的選擇

取濃度為100 ng/mL的溴敵隆與大隆標準溶液，ESI負離子模式下，采用微量蠕動泵連續進樣，一級質譜全掃描，來確定二者的準分子離子。溴敵隆與大隆的準分子離子峰分別為525.2(m/z)和521.0(m/z)。以溴敵隆和大隆的準分子離子峰為母離子進行二級質譜掃描，選豐度最高的兩個特征碎片離子作為定性定量離子。對特征離子對的去簇電(Declustering-potential，DP)、碰撞能量 (Collision energy，CE ) 碰撞室入口電壓(Entrance potential，EP)和出口電壓(Collision cell exit potential，CXP) 進行優化。相關主要質譜參數如表1所示。

2.2 液相色譜條件的選擇

在實驗過程中分別比較了體積比為1:1乙腈-甲醇溶液、0.1%甲酸-水、0.1%甲酸-甲醇、0.1%甲酸-乙腈、0.1%甲醇-乙腈、水-乙腈共6種流動相對分析結果的影響。當流動相為0.1%甲酸-水溶液時，溴敵隆和大隆的峰形和分離效果都比較理想，因此實驗過程中選擇0.1%甲酸-水溶液和體積比為1:1乙腈-甲醇溶液為流動相進行梯度洗脫。溴敵隆和大隆的MRM圖質譜圖分別如圖1和圖2所示。

圖1 溴敵隆和大隆的總離子流圖Fig.1 TIC of bromoadiolone and brodifacoum

圖2 溴敵隆和大隆的MRM圖Fig.2 MRM chromatogram of bromoadiolone and brodifacoum

2.3 介質液液萃取(SLE)條件的優化

在空白血液基質中配制含有溴敵隆和大隆均為100 ng/mL的標準溶液并采用UPLC/MS/MS進行檢測分析。

2.3.1 萃取體系pH值的選擇

傳統液液萃取方法提取血中溴敵隆和大隆，一般不需要添加緩沖溶液。在本實驗中采用液液萃取柱，不添加緩沖溶液，僅根據溴敵隆和大隆的溶解性，分別采用乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷進行提取，結果顯示溴敵隆和大隆的回收率均小于1%。若添加酸性緩沖溶液則能大幅度提高溴敵隆和大隆的回收率。

在實驗過程中固定平衡時間為2 min、溶劑使用4 mL×2乙酸乙酯，考察萃取體系的pH值分別為2、4、6、7條件下萃取效率變化。結果發現萃取體系的pH值為2時，溴敵隆和大隆回收率最高。這可能是因為溴敵隆和大隆均為弱酸性結構的原因。因此實驗過程中選擇萃取體系的pH值為2。

2.3.2 萃取溶劑的選擇

固定萃取體系的pH值為2、平衡時間為2 min、溶劑使用量為4 mL×2，考察乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷以及二元混合溶劑乙酸乙酯+氯仿=1+1、乙酸乙酯+二氯甲烷=1+1幾種萃取溶劑的萃取效果。結果發現使用乙酸乙酯作為萃取溶劑時溴敵隆和大隆的回收率均大于85%，回收效果較好。因此實驗過程中選擇乙酸乙酯作為溴敵隆和大隆的萃取溶劑。

2.3.3 萃取溶劑用量的選擇

固定pH條件為2、平衡時間為2 min、溶劑使用乙酸乙酯，當萃取溶劑使用量分別為2 mL×2、3 mL×2、4 mL×2時，溴敵隆和大隆的回收率隨萃取溶劑用量的增加而增加。當萃取溶劑使用量為5 mL×2時，溴敵隆和大隆的回收率反而有所降低。因此實驗過程中選擇乙酸乙酯的用量為4 mL×2。

2.3.4 平衡時間的選擇

固定pH條件為2、使用4 mL×2乙酸乙酯作為萃取溶劑，當樣品均勻分散在SLE柱填料上以后，考察靜置時間分別為2 min、5 min、10 min時溴敵隆和大隆的回收率。結果發現當平衡時間為2 min時，溴敵隆的回收率最高，隨著平衡時間的增加溴敵隆的回收率開始下降。但大隆的回收率隨平衡時間的變化較小。因此選擇2 min為實驗過程的平衡時間。

2.4 方法驗證

2.4.1 工作曲線和方法檢出限

在空白血液基質中配制含有溴敵隆和大隆均為5、10、25、50、100、200 ng/mL 6個濃度水平的添加血，按選定的色譜和質譜條件進行測定。以峰面積(y)對樣品中溴敵隆和大隆的質量濃度(x, ng/mL)作圖，溴敵隆和大隆的線性范圍、線性回歸方程和相關系數如表2所示。采用的含有溴敵隆和大隆均為1 ng/mL的添加血，按上述試驗方法進行檢測分析，以豐度較低的子離子峰強度的信噪比(S/N)為3計算溴敵隆和大隆的檢出限(LOD)分別為0.1 ng/mL和0.092 ng/mL。

表2 溴敵隆和大隆的線性參數及檢出限Table 2 Linear equation, correlation coefficient, linear range and LOD of bromoadiolone and brodifacoum

2.4.2 方法的加標回收率和精密度

表3 溴敵隆與大隆在空白血液中的加標回收率和精密度(n=6)Table 3 Recoveries and precision of bromoadiolone and brodifacoum in spiked blank blood

采用空白血樣加標的方式進行回收率實驗，在線性范圍內分別加入濃度為10，50，200 ng/mL的溴敵隆和5，50，200 ng/mL的大隆，按照以上所選定的實驗方法平行測定6次，兩種目標化合物的平均回收率78.7%～95.8%，RSD為3.3%～8.6%，具體數據如表3所示。

3 結 論

本研究利用SLE技術結合高效液相色譜-三重四級桿/復合線性離子阱質譜建立了血液中溴敵隆和大隆的檢測方法。利用該檢測方法對血液中的溴敵隆和大隆進行了定性與定量分析。實驗結果表明本方法具有良好的靈敏度、精密度和重現性，能快速高效檢測血液中的溴敵隆和扎大隆，滿足偵查、訴訟及醫療急救的檢測要求。