酒精性肝病患者血清IL-17水平變化及其197A/G位點單核苷酸多態性分析

尹春英，侯志平，王春青，王艷玲，李炳慶，何培元

1承德醫學院附屬醫院，河北承德067000；2承德醫學院

酒精性肝病是由長期過量飲酒所致的肝臟損傷，嗜酒者的病死率較一般人群高1～3倍，肝臟疾病、神經系統疾病的發病率較一般人群高20%[1，2]。酒精性肝病的發展包括酒精性脂肪肝、酒精性肝硬化及酒精性肝癌不同階段[3]，其中酒精性脂肪肝的病理學改變是可逆的，如給予有效治療，患者可能恢復健康；而酒精性肝硬化則不可逆轉，治療效果差，預后不良，約15%的酒精性肝硬化患者可發展為肝細胞癌。白細胞介素17(IL-17)是一種新型細胞因子，最早從小鼠細胞毒性T河馬細胞雜交瘤中分離出來[4,5]，參與體內病毒免疫反應，可激活細胞因子引發炎癥因子風暴，參與多種炎性疾病的發生發展[6～8]。本研究通過觀察酒精性肝病患者血清IL-17水平及其197A/G位點單核苷酸多態性(SNP)特點，分析其與酒精性肝病發生發展的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年1月～2018年6月在我院就診的酒精性肝病患者182例，男159例、女23例，年齡(51.2±7.4)歲。其中脂肪肝32例(脂肪肝組)，肝硬化68例(肝硬化組)，肝癌24例(肝癌組)。納入標準：符合中華醫學會肝臟病學分會2010年修訂的《酒精性肝病診療指南》[9]中的診斷標準：①長期大量飲酒，飲酒時間≥5年，折合乙醇量男性≥40 g/d、女性≥20 g/d，或2周內飲用乙醇量>80 g/d；②臨床癥狀：可無明顯癥狀，或表現為右上腹脹痛、乏力、食欲不振、體質量下降、皮膚鞏膜黃染等，隨病情進展，可出現蜘蛛痣、肝掌及神經精神異常等表現；③實驗室檢查：血清天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、谷氨酰轉肽酶、平均紅細胞容積升高，AST/ALT>2；④肝臟B超或CT檢查有典型彌漫性脂肪肝表現。排除標準：肝臟病變進入終末期，已經行肝移植手術；酒精性脂肪性肝病合并嗜肝病毒感染；合并藥物性肝病或自身免疫性肝炎；合并惡性腫瘤；合并心、肝、腦、肺等嚴重損傷。對照組58例來自同期健康體檢者，年齡33～69歲。入選標準：長期大量飲酒；肝功能正常；肝臟B超或CT檢查未見異常；無酒精性肝病家族史；無心、腦、腎等重要臟器疾病。各組性別、年齡、飲酒量具有可比性。本研究經承德醫學院附屬醫院倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

1.2 血清IL-17檢測方法 采集受試者外周血，離心分離血清。采用ELISA試劑盒(武漢華美生物工程有限公司)檢測血清IL-17活性。設置標準品孔、樣本孔和空白孔，依次加入樣本、辣根過氧化物酶標記的檢測抗體、37 ℃溫育60 min，棄去液體，加入洗滌液，重復洗板5次，最后加入底物，37 ℃避光孵育15 min。使用熒光酶標儀在490 nm處讀取IL-17吸收值，繪制標準曲線，計算IL-17的相對表達量。

1.3 IL-17 197A/G的SNP檢測方法 使用DNA試劑盒提取血清總DNA，PCR擴增儀進行擴增。擴增引物：上游5′-AACAAGTAAGAATGAAAAGAGGACATGGT-3′，下游5′-CCCCCAATGAGGTCATAGAAGAATC-3′，延伸引物TACCCTTGCTAAGGCTTCTTGCCGA。反應條件：95 ℃預變性10 min；94 ℃ 變性30 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35個循環；最后72 ℃延伸10 min。使用單核苷酸檢測試劑盒(美國SNP IT試劑盒)，將獲得的PCR產物純化后，模板變性、擴增，去除多余的ddNTP，采用ABI3730電泳進行SNP分析。

1.4 統計學方法 采用SPSS12.0統計軟件。197A/G等位基因及基因型SNP在不同組間的分布頻率用χ2檢驗；組間IL-17表達水平比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組血清IL-17水平比較 對照組、脂肪肝組、肝硬化組、肝癌組血清IL-17水平分別為3.78±0.45、3.96±0.62、6.23±0.88、8.77±0.93；肝癌組血清IL-17水平高于其他三組(P均<0.05)，肝硬化組高于脂肪肝組和對照組(P均<0.05)，脂肪肝組與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2 各組IL-17 197A/G位點基因型及等位基因分布頻率比較 見表1。197A/G位點有AA、AG、GG三種基因型，三種基因型的分布頻率在四組間比較差異有統計學意義(χ2=46.20，P<0.01)。肝癌組、肝硬化組AA基因型分布頻率均高于AG、GG型，脂肪肝組、對照組GG基因型分布頻率均高于AA、AG型(P均<0.05)；肝癌組、肝硬化組AA基因型分布頻率高于對照組和脂肪肝組，GG基因型分布頻率低于對照組和脂肪肝組(P均<0.05)。等位基因A在肝癌組分布頻率最高，肝硬化組次之，兩組間無統計學差異(P>0.05)，但是與脂肪肝組及對照組均具有統計學差異(P均<0.05)；等位基因G在脂肪肝組和對照組分布頻率高于肝硬化組和肝癌組(P均<0.05)。

表1 各組IL-17 197A/G位點基因型及等位基因分布頻率比較[例(%)]

3 討論

酒精性肝病是由于長期過量攝入乙醇導致的肝臟慢性中毒性疾病。隨著我國國民生活水平的提高及生活習慣的改變，酒精性肝病已成為導致肝硬化及肝癌的主要病因[10]。酒精性肝病的病理發展過程包括酒精性脂肪肝、酒精性肝硬化和酒精性肝癌三個階段。其中酒精性脂肪肝是酒精性肝損傷的早期可逆性損傷階段，一般在戒酒和治療后多數患者預后良好；當患者進入肝硬化階段后即稱為失代償期，對于患者只能對癥治療、改善肝功能及治療并發癥。酒精性肝病致病因素單一，但其發病機制較為復雜，從酒精性脂肪肝到酒精性肝硬化階段，其本質是肝臟的慢性持續性損傷導致肝細胞在反復損傷及修復過程中出現的壞死、再生及間質纖維結締組織增生引起的肝臟組織結構和功能發生的改變，這一過程可能與乙醇及其代謝產物對肝臟的毒性作用、氧化應激與脂質過氧化、免疫介導、細胞凋亡、細胞因子、內毒素、SNP、病毒的疊加效應等多種因素有關[11，12]。

CD4+T淋巴細胞依據其生物學特性，可分為調節性T細胞(Treg)、輔助性T細胞17(Th17)、Th1及Th2細胞4個亞群。Th17細胞是新發現的一類效應性T細胞，可分泌IL-17、IL-17F、TNF-α、IL-21、IL-22、IL-17B、IL-17C、IL-17E，與機體的炎癥反應、自身免疫性疾病及腫瘤的發生發展密切相關。Lemmers等[13]研究認為，Th17通路在酒精性肝病中發揮重要作用，酒精中毒性肝損傷患者及酒精性肝硬化患者血漿IL-17水平明顯升高，且肝臟分泌IL-17的細胞數量與肝細胞損傷程度呈正相關。目前研究認為，長期攝入乙醇導致IL-17增加，進一步刺激肝星狀細胞表達TNF-α、TGF-β[14]，進而促進細胞凋亡蛋白酶活化導致肝細胞凋亡[15]、抑制自然殺傷細胞的活性而減弱其抗纖維化的作用[16]。有報道顯示，IL-17還可以激活其他細胞因子，引起炎癥反應的級聯效應，最終促進疾病進展。本研究結果顯示，酒精性肝硬化、酒精性肝癌患者血清IL-17水平均高于對照組和酒精性脂肪肝組，其中肝癌組最高。表明不可逆性酒精性肝損傷可導致IL-17水平異常升高，在病情進展過程中發揮重要作用。

本研究進一步觀察酒精性肝病患者IL-17 197A/G位點的基因多態性，結果顯示，AA基因型頻率在肝癌患者中最高，在肝硬化組中次之，在對照組和脂肪肝組中分布頻率最低。這提示酒精性肝病的進展在人群中存在不同的遺傳背景，AA基因型分布趨勢與IL-17血清表達趨勢相似，表明AA基因型和A等位基因可能是酒精性肝病患者致病的不利因素。AA基因型在對照組和脂肪肝組中表達無差異，同時在肝硬化組和肝癌組中也無差異，表明AA基因型在酒精性肝病不可逆損傷中發揮重要作用，攜帶AA基因型的患者更易引起肝硬化損傷。與以往文獻報道[17～19]一致。何勝等[20]報道，在乙型肝炎病毒引起的肝硬化患者中，197A/G位點AA基因型和A等位基因可能增加乙肝病毒感染的不良轉歸，并且AA基因型可以增加慢性乙型肝炎進展為肝硬化的發生風險。但是攜帶該基因型的患者酒精性肝病進程尚未揭示，這類患者是飲酒后從酒精性脂肪肝逐步進展到酒精性肝硬化再到酒精性肝癌，還是大量飲酒后快速從酒精性脂肪肝發展到肝硬化或肝癌階段，目前尚不清楚。

綜上所述，IL-17 197A/G位點AA基因型和A等位基因是酒精性肝病患者的易感基因，AA基因型分布頻率與肝硬化患者血清IL-17水平趨勢相似，可以增加酒精性脂肪肝進展為肝硬化的發生風險。但是由于不同人群的遺傳背景不同，報道也不盡一致，為了避免由于樣本量不足引起的偏倚，應該在不同人種、種族和地區間增大樣本量進一步深入研究。