Shh信號通路抑制劑環巴胺對裸鼠皮下人直腸癌移植瘤形成的影響

蘇晉捷，姚城，劉曉平，卡達爾江，李天明，林榮杰，曾翔輝，王瑞，何安全

1克孜勒蘇柯爾克孜自治州人民醫院，新疆阿圖什845350；2深圳市薩米國際醫療中心；3贛南醫學院第一附屬醫院

結直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，其發病率和病死率呈逐年上升趨勢,目前手術是其主要治療方法[1]。大多數結直腸癌患者就診時已處于癌癥進展期，部分患者失去手術機會，而部分患者術后出現復發及轉移[2]。盡管輔助放化療可延緩疾病進展，但其不良反應大，嚴重影響患者生活質量，且易導致患者死于各種并發癥。目前結直腸癌的治療還有待進一步提高，新的治療手段如基因靶向治療有望成為治愈的有效手段。研究顯示，Shh信號通路在調控胚胎發育和干細胞分化中具有重要作用，其異常激活與惡性腫瘤的發生、發展密切相關[3，4]。環巴胺是一種異甾體類生物堿，其抗腫瘤作用與Shh介導的Hedgehog信號通路有關，能夠抑制腫瘤基因的轉錄與表達，進而抑制腫瘤形成[5，6]。其抗腫瘤作用在胰腺癌、前列腺癌等體內或體外實驗中均得到證實[7，8]。Shh信號通路異常激活與結直腸癌相關[9，10]，然而環巴胺與結直腸癌的關系目前報道較少。2018年7～12月，我們觀察了Shh信號通路抑制劑環巴胺對裸鼠皮下人直腸癌移植瘤形成的影響，旨在為直腸癌的靶向治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑與儀器 4～5周齡SPF級BALB/C-nu/nu裸鼠60只，雌雄各半，體質量15～18 g，由中山大學實驗動物中心提供。HR8348人直腸癌細胞由中山大學細胞實驗中心提供。Shh信號通路抑制劑環巴胺、水合氯醛(Sigma，美國)，PBS(Gibco，美國)。顯微鏡(奧林巴斯，日本)，細胞恒溫培養箱及電熱恒溫干燥箱(杭州碩聯，中國)。

1.2 細胞培養 取HR8348細胞，加入含10%小牛血清的RPMI1640培養液，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養箱中培養。

1.3 動物分組與腫瘤移植、藥物干預 將60只裸鼠隨機分為對照組和同時給藥組、延遲給藥組，每組各20只。分別于裸鼠左后肢外側皮下一次性注射1.0×106個HR8348細胞建立移植瘤模型。對照組建模后立即注射生理鹽水0.2 mL；同時給藥組建模后立即注射20 μmol/L環巴胺0.2 mL，1次/d；延遲給藥組建模5 d后肉眼可見腫瘤長出，給予皮下注射20 μmol/L環巴胺0.2 mL，1次/d。

1.4 移植瘤形成情況觀察 分別于給藥10 d、20 d，三組各取10只裸鼠處死。取出腫瘤，用天平稱量腫瘤質量，移植瘤質量抑制率=(1-給藥組移植瘤質量/對照組移植瘤質量)×100%。選取移植瘤最大切面(橫切面及縱切面)，用游標卡尺測量最大切面長(a)、寬(b)、高(c)，代入V=(πabc)/6計算移植瘤體積，移植瘤體積抑制率=(1-給藥組移植瘤體積/對照組移植瘤體積)×100%。取腫瘤組織行常規HE染色，光鏡下腫瘤細胞核大深染呈藍紫色，異型性明顯，判定為陽性細胞。隨機觀察5個高倍視野，計數陽性細胞數。移植瘤細胞密度=給藥組陽性細胞數/對照組陽性細胞數×100%。

2 結果

所有裸鼠5 d后均成功長出肉眼可見的直腸癌移植瘤。兩組給藥10 d、20 d后的移植瘤體積、質量及細胞密度比較見表1。與延遲給藥組相比，同時給藥組10 d、20 d后的移植瘤體積抑制率、質量抑制率均升高，細胞密度均降低(P均<0.05)；與給藥10 d后相比，兩組給藥20 d后的移植瘤體積抑制率、質量抑制率均升高，細胞密度均降低(P均<0.01)。

表1 兩組給藥10 d、20 d后的移植瘤體積抑制率、質量抑制率及細胞密度比較

3 討論

手術是結直腸癌的主要治療方法，但部分患者術后會出現復發及轉移；輔助放化療可延緩疾病進展，但不良反應大，嚴重影響患者生活質量，且易導致各種并發癥。研究顯示，多種信號轉導途徑在結直腸癌中呈激活狀態，靶向抑制這些信號通路可能成為一種新的治療結直腸癌的手段。Hedgehog基因是胚胎發育的一個關鍵調控靶點，它誘導哺乳動物精子和軟骨的分化，神經系統、運動系統、消化系統、眼睛、皮膚的形成，以及與器官對稱性發育相關，其異常激活與惡性腫瘤的發生、發展密切相關[10]。研究表明，在結腸癌、乳腺癌等惡性腫瘤中均存在Shh信號的異常激活[7，11]。

環巴胺是一種異甾體類生物堿，其抗腫瘤作用與Shh基因介導的Hedgehog信號通路有關，使腫瘤基因的轉錄與表達受到抑制，從而抑制信號通路的活性，抑制腫瘤形成的過程。本研究用人直腸癌細胞株HR8348建立裸鼠直腸癌移植瘤模型，分別于建模同時及肉眼可見移植瘤時注入環巴胺，觀察環巴胺對裸鼠直腸癌移植瘤生長的影響。與對照組相比，同時給藥組和延遲給藥組的移植瘤體積抑制率、移植瘤質量抑制率均明顯上升；連續給藥20 d后，同時給藥組和延遲給藥組的移植瘤體積抑制率、質量抑制率明顯高于連續給藥10 d后。表明環巴胺可抑制裸鼠直腸癌移植瘤生長，隨著用藥時間延長，環巴胺對直腸癌移植瘤生長的抑制率越高。

研究表明，低分化癌組織中，低分化甚至未分化的腫瘤的細胞密度比例較高，其間可見部分壞死及液化區域，腫瘤細胞密度與細胞液化、壞死、以及細胞增殖密切有關，腫瘤細胞密度可反映細胞生長速度[12]。環巴胺具有抗腫瘤作用，可抑制多種腫瘤細胞的生長、轉移和浸潤。本研究結果顯示，連續用藥10 d后，同時給藥組和延遲給藥組移植瘤細胞密度小于對照組；連續用藥20 d后，同時給藥組和延遲給藥組的移植瘤細胞密度小于對照組，且同時給藥組較延遲給藥組降低更明顯。這表明不同時間皮下注射環巴胺，對移植瘤細胞生長的抑制效果不同，早期皮下注射環巴胺抑制效果更佳。提示環巴胺對腫瘤未形成時、腫瘤形成時均有抑制作用，既可用于術前的輔助治療，也能用于晚期腫瘤患者的治療或預防術后復發。

總之，環巴胺可抑制裸鼠直腸癌移植瘤生長，且隨著用藥時間延長，其抑制作用愈加明顯。本研究的結果為進一步探討環巴胺與直腸癌惡性行為關系提供了理論依據，也為直腸癌靶向治療提供了新的靶標。