銀離子-聚酰胺紗布敷料覆蓋促進燒傷感染模型大鼠創面愈合的作用及其機制

馬燕，靳媛媛，李燦，黃智勇，王德懷，劉漪淪

1成都市第二人民醫院，成都610011；2成都醫學院第一附屬醫院；3成都醫學院

燒傷為臨床常見病，若不能獲得及時有效治療，易引發局部、全身炎性反應，甚至發生不可控感染和死亡[1]。既往多采用口服抗生素治療燒傷，但抗生素難以到達創面，常無法有效控制創面感染[2]。研究顯示，外敷藥物可直接作用于感染創面，能夠有效抑制炎性反應、促進皮損修復，并緩解疼痛，有助于患者康復[3]。目前臨床上使用的普通紗布敷料多為凡士林，僅能起到掩蓋創面的作用，保濕效果不佳，在治療過程中不能保護創面及創周清潔；聚酰胺紗布敷料比普通紗布有更好的保濕及緩解疼痛的效果，在臨床上得到越來越多的應用，但在促進傷口愈合方面的效果還有待提高[4]。銀離子-聚酰胺紗布敷料為我院自行研制的新型抗菌敷料，2018年3月～2019年3月，我們通過建立燒傷感染大鼠模型，觀察銀離子-聚酰胺紗布敷料對大鼠相關血管相關因子、炎性介質及疼痛介質等的影響，評價銀離子-聚酰胺紗布敷料治療燒傷感染創面的效果。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑與儀器 SPF級SD健康大鼠60只，購自長沙市天勤生物有限公司。屏障環境、正常飲食，適應性飼養1周后用于實驗。硝酸銀(湖南爾康制藥股份有限公司)、聚維酮K-30(哈爾濱樂泰藥業有限公司)、檸檬酸三鈉(北京奧萊博科技有限公司)，VEGF大鼠單克隆抗體、MMP-2大鼠單克隆抗體、MMP-9大鼠單克隆抗體、β-actin大鼠單克隆抗體(英國Abcam)，BCA Protein Assay Kit(上海碧云天)，PVDF膜(美國Bio-Rad)，免疫組化試劑盒(森貝伽)，HE染色劑、PBS緩沖液(武漢博士德),山羊抗鼠HRP抗體(上海滬峰化工)，化學發光顯色試劑盒(美國Thermo Fisher SCIENTIFIC)；鼠β-內啡肽(β-EP)、5-羥色胺(5-HT)、IL-1β、TNF-α ELISA試劑盒(上海AMEKO)。Bio-Rad凝膠成像儀、Motic6.0圖像分析系統及Motic顯微鏡(麥克奧迪)。

1.2 銀離子-聚酰胺紗布敷料制備 將400 mg硝酸銀加入1 L蒸餾水充分攪拌，依次加入300 mg聚維酮K-30、300 mg檸檬酸三鈉，紫光燈照射、磁力攪拌下反應4～5 h，得到銀離子復合物混合液。將混合液離心，棄上清，烘干。稱取適量的加入去離子水制成240 μg/mL的銀離子復合物溶液。取聚酰胺紗布敷料，無菌水沖洗，濾紙吸去表面液體，浸入銀離子復合物溶液48 h后取出。經掃描電子顯微鏡觀察，可見聚酰胺紗布敷料表面及內部均有大量銀顆粒，覆蓋均勻，散在分布。

1.3 混合菌液制備 挑取金黃色葡萄球菌ATCC25923標準菌株、銅綠假單胞菌標準菌株ATCC27853至肉湯培養基，調整細菌密度為1×108CFU/mL。兩種菌株各取100 μL置于96孔板，37 ℃孵育7 d。

1.4 動物分組與處理 大鼠腹腔注射0.01 mL/g戊巴比妥鈉麻醉，剃去背部單側毛發，以吸管吸取沸水，將脫去毛發部位燙傷，面積為3 cm×3 cm。燙傷3 d后，于燙傷部位皮下注射混合菌液50 μL。7 d后，按照隨機數字表法將成模大鼠分為對照組、Polyamide組、Ag-Polyamide組各20只,分別以普通紗布敷料、聚酰胺紗布敷料、銀離子-聚酰胺紗布敷料覆蓋感染創面，棉墊繃帶適力包扎固定。每3 d換藥1次，共治療15 d。

1.5 創面愈合情況評價 ①創面愈合率：治療前及治療15 d后，使用刻度表尺標定創面，測量創面面積，計算創面愈合率，創面愈合率=(治療前創面面積-治療15 d創面面積)/治療前創面面積×100%。②愈合時間：從治療開始到創面愈合率達80%的時間。③燒傷組織含水量：取創面全層皮膚200 mg，以吸水紙吸干表面水分，稱取濕重；烘干，稱取干重。含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。④抑菌率：采用燒瓶振蕩法[5]檢測，抑菌率=(治療前平均菌落數-治療后平均菌落數)/治療前平均菌落數×100%。⑤瘢痕評分：使用VSS量表中文版[6]評價燒傷創面瘢痕增生情況，包括血管分布、瘢痕厚度、色澤及柔軟度4個維度，量表總分15分，分值越低說明瘢痕增生程度越輕。

1.6 血清疼痛介質β-EP、5-HT檢測 治療前及治療15 d分別從尾靜脈取血5 mL，EDTA抗凝，4 ℃、3 000 r/min離心20 min，收集上清。使用ELISA試劑盒檢測β-EP、5-HT水平。

1.7 創面組織病理學檢查 采用免疫組化法。治療前及治療15 d后，麻醉大鼠，取創面中央位2 cm×2 cm的正方形組織，一部分冷凍備用，另一部分加入4%甲醛溶液固定48 h，脫水、浸蠟、包埋、切片、脫蠟，按照SP試劑盒說明書進行免疫組化染色。自來水沖洗，蘇木素復染，常規脫水，透明，干燥，封片。采用Motic顯微鏡放大10倍觀察。

1.8 創面組織中炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α檢測 取冷凍的創面組織加入PBS勻漿，2 000 r/min離心20 min，取上清。使用ELISA試劑盒檢測IL-6、IL-1β、TNF-α水平。

1.9 創面組織中血管相關因子VEGF、MMP-2、MMP-9表達檢測 采用Western blotting法。取冷凍組織加入RIPA裂解液充分勻漿，4 ℃離心15 min，取上清，采用BCA法測定蛋白濃度。取40 μg蛋白用于SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入相應的一抗，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜，加入二抗，室溫孵育2 h。采用化學發光顯色試劑盒顯色，Bio-Rad凝膠成像儀拍照，Motic6.0圖像分析系統讀取相對值。

2 結果

2.1 三組創面愈合情況比較 見表1。

表1 三組創面愈合情況比較

2.2 三組治療前后血清β-EP、5-HT水平比較 見表2。

表2 三組治療前后血清β-EP、5-HT水平比較

2.3 三組創面組織病理變化比較 對照組創面可見毛囊、皮脂腺和深層的肌肉組織尚存，但肌肉組織有明顯的變性壞死，創面表皮增生，毛細血管、纖維母細胞繼續增生。Polyamide組創面肌肉組織變性壞死較對照組減輕，炎癥反應不明顯，創面已上皮化。Ag-Polyamide組創面完全上皮化，上皮細胞分化良好。

2.4 三組治療前后創面組織中VEGF、MMP-2、MMP-9表達比較 見表3。

表3 三組治療前后創面組織中VEGF、MMP-2、MMP-9表達比較

2.5 三組治療前后創面組織中IL-6、IL-1β、TNF-α水平比較 見表4。

表4 三組治療前后創面組織中IL-6、IL-1β、TNF-α水平比較

3 討論

金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌是常見的皮膚條件致病菌，可分泌大量蛋白酶和毒力因子，妨礙傷口閉合。目前對于燒傷感染臨床多采取抗生素治療，盡管口服抗生素可清除進入機體的細菌，但難以有效清除創面細菌，致使局部反復感染，加重病情。外用敷料直接覆蓋于創面，既可有效阻止外界細菌散落于創面，又可使藥物接觸創面，直接發揮清除細菌、抑制炎性反應、緩解疼痛、促進創面恢復的作用。聚酰胺紗布通透性好，質地柔軟，無刺激，有助于創口生長[7]。由于聚酰胺分子的極性酰胺鍵具有較強的吸水性，因此聚酰胺紗布敷料具有良好的保濕性能，可避免創面與敷料粘連，減少換藥疼痛，但在促進傷口愈合方面的效果還有待提高。研究顯示，銀離子與細菌體內的含巰基蛋白相結合，使其變性、失活，抑制巰基酶參與的各種生命活動；銀離子可結合DNA堿基，致使細菌DNA變性，誘導細菌死亡[8，9]。將銀與聚酰胺結合制成新型的銀離子-聚酰胺紗布敷料，可以減少換藥次數，簡化換藥流程，避免多次換藥導致的細菌感染及對創面組織的傷害，緩解患者疼痛，從而促進創面愈合。本研究結果顯示，Ag-Polyamide組創面愈合率、燒傷組織含水量、抑菌率均高于對照組和Polyamide組，創面愈合時間、瘢痕評分低于對照組和Polyamide組，表明與普通紗布敷料、聚酰胺紗布敷料相比較，銀離子-聚酰胺紗布敷料可促進創面愈合，保持燒傷組織含水量，抑制細菌增殖，促進組織修復，避免瘢痕生成。Ag-Polyamide組創面組織病理變化均優于其他兩組，表明銀離子-聚酰胺紗布敷料更有助于燒傷組織修復。

β-EP為內源性阿片肽，當外周組織損傷或發生炎性反應時，該部位的白細胞可分泌大量β-EP，且其水平與組織損傷及炎性反應程度呈正相關。5-HT可作用于腎上腺素β受體，誘導其生成前列腺素，促進胺類物質生成并作用于交感神經引發疼痛[10]。本研究結果顯示，治療后Ag-Polyamide組β-EP、5-HT水平低于Polyamide組、對照組，提示銀離子-聚酰胺紗布敷料可有效抑制疼痛介質生成，緩解疼痛。

VEGF為促血管生成因子，可提高血管通透性，促進形成細胞外基質，加速內皮細胞移行，促進新生血管形成[11]。MMP-2、MMP-9為蛋白水解酶，可促進細胞外基質及基底膜降解，破壞基質與組織細胞間的聯系，促進炎性細胞浸潤，進一步破壞組織[12]。本研究結果顯示，治療15 d后，Ag-Polyamide組VEGF表達水平高于對照組、Polyamide組，MMP-2、MMP-9表達水平低于其他兩組，提示銀離子-聚酰胺紗布敷料可促進燒傷組織生成VEGF，抑制MMP-2、MMP-9表達，進而促進新生血管形成，具有促進感染創面修復的作用。

IL-6是介導急性炎性反應的重要介質，可抑制多種炎性介質生成，在燒傷修復中具有抗炎的作用，其水平快速升高說明機體處于較強的炎性反應狀態[13];IL-1β可誘導間質細胞生成蛋白分解酶，促進創面組織蛋白分解，抑制創面修復[14];TNF-α水平與機體炎性反應程度呈正相關，是評價燒傷感染程度和創面預后評估的重要標志物[15]。本研究結果顯示，治療后Ag-Polyamide組IL-6、IL-1β、TNF-α水平低于對照組、Polyamide組，表明銀離子-聚酰胺紗布敷料可有效抑制炎性介質生成。

綜上所述，銀離子-聚酰胺紗布敷料可有效抑制燒傷感染模型大鼠創面細菌，減少炎性介質、疼痛介質生成，緩解疼痛，刺激生成VEGF，促進創面恢復，提高創面愈合率。