苦參堿對血管平滑肌細胞增殖和凋亡的影響及機制

李小丹，高婉琴，王京

1西安大興醫(yī)院，西安710016；2延安大學(xué)附屬醫(yī)院

動脈粥樣硬化性血管病變的外科治療包括經(jīng)皮介入治療和藥物治療無效的外科手術(shù)治療。然而，這兩種方法均與再狹窄的頻繁發(fā)生有關(guān)，再狹窄的發(fā)生主要是由于內(nèi)膜增生和動脈粥樣硬化的復(fù)發(fā)。血管平滑肌細胞在再狹窄形成中起著關(guān)鍵作用。再狹窄的病理機制包括內(nèi)膜損傷和平滑肌細胞的增殖、遷移[1，2]。正常情況下，血管內(nèi)皮作為屏障可以防止平滑肌細胞受血液刺激，當血管內(nèi)膜被球囊或支架損傷時，平滑肌細胞與循環(huán)中的生長因子發(fā)生接觸，導(dǎo)致細胞異常增殖并在血管損傷處堆積，形成新生內(nèi)膜，造成局部血管腔再次狹窄。蛋白激酶B(AKT)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路參與細胞代謝、生長、增殖、分化、凋亡、自噬等多種生理過程[3]。苦參堿是由豆科植物苦參的干燥根、植株、果實經(jīng)乙醇等有機溶劑提取而成，研究表明，苦參堿可誘導(dǎo)多種實體腫瘤如結(jié)直腸癌、肝癌、宮頸癌以及血液惡性腫瘤如單核細胞白血病淋巴瘤細胞凋亡[4～7]。2018年1月～2019年10月，我們觀察了苦參堿對血管平滑肌細胞增殖和凋亡的影響，并探討AKT/mTOR信號通路在其中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 苦參堿購自百靈威科技有限公司，用PBS溶解。血管平滑肌細胞株MOVAS細胞購自美國ATCC公司。胎牛血清(FBS)、高糖DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司。青鏈霉素混合液購自Hyclone公司。CCK-8試劑盒購自日本同仁公司。AKT/mTOR信號通路相關(guān)蛋白AKT、mTOR及其下游底物核糖體蛋白S6激酶(p70S6K)、真核起始因子4E結(jié)合蛋白1(4EBP1)抗體均購自美國Abcam公司。p-AKT、p-mTOR、p-p70S6K、p-4EBP1購自美國CST公司。RAPI裂解液和BCA法蛋白濃度檢測試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑均購自美國羅氏公司。PVDF膜和ECL發(fā)光液均購自Millipore公司。細胞周期檢測試劑盒購自北京達科為生物技術(shù)有限公司。ELISA凋亡試劑盒購自羅氏公司，Caspase-3活性檢測試劑盒購自北京諾博萊德科技有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 取MOVAS細胞，加入含10%FBS和青鏈霉素混合液的DMEM高糖培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。細胞長滿后加入0.25%胰酶消化，用含血清的培養(yǎng)液中和胰酶，1 500 r/min離心5 min。用新鮮培養(yǎng)液將細胞沉淀、重懸，吹打成單細胞懸液，按1∶3的比例進行細胞傳代。

1.3 苦參堿最佳作用濃度的篩選 采用CCK-8法。將對數(shù)生長期細胞，加入0.25%胰酶消化，按1×104/孔接種至96孔板，培養(yǎng)至細胞貼壁。加入0.5、1、5、10、100 μmol/L苦參堿溶液，分別作用24、48、72 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。用酶標儀測定在450 nm處的吸光度。用GraphPad Prism7.04軟件繪制增殖曲線，結(jié)果顯示苦參堿對MOVAS細胞增殖的抑制作用具有濃度依賴性，隨苦參堿濃度的增加，其對細胞增殖的抑制作用增強。曲線回歸計算苦參堿對MOVAS細胞增殖抑制的EC50是7.6 μmol/L，因此本研究選擇5、10 μmol/L進行后續(xù)實驗。

1.4 細胞周期檢測 取對數(shù)生長期細胞，按1×106/孔接種于6孔板。待細胞貼壁后，將其分為5 μmol/L苦參堿組、10 μmol/L苦參堿組及對照組，分別加入5、10 μmol/L苦參堿和無菌PBS溶液作用24 h。加入胰酶消化細胞，1 500 r/min離心5 min。用新鮮的培養(yǎng)液將細胞沉淀重懸并吹打成單個細胞懸液，用預(yù)冷的PBS將細胞沉淀洗兩次。用75%乙醇固定，4 ℃過夜。第2天1 500 r/min離心5 min，棄上清。用PBS洗滌兩次，加入溴化乙錠(PI)染液，室溫避光染色30 min。用400目篩過濾后上機，計數(shù)2×104個細胞，分析各細胞周期細胞比例。

1.5 細胞凋亡檢測 采用ELISA法。取對數(shù)生長期細胞，加入0.25%胰酶消化，以1×104/孔接種至96孔板，培養(yǎng)至90%融合。將細胞分為5 μmol/L苦參堿組、10 μmol/L苦參堿組及對照組，分別加入5、10 μmol/L苦參堿和無菌PBS溶液作用24 h。收集細胞，1 000 r/min離心10 min，取20 μL上清液加入鏈霉親和素包被的培養(yǎng)板孔中。加入80 μL免疫反應(yīng)試劑，室溫搖床孵育2 h。取上清，用溫育緩沖液洗滌3次，加入100 μL底物緩沖液，室溫搖床孵育10～20 min，上酶標儀測定405 nm波長處的光密度(OD)值，以底物緩沖液作為空白對照。

1.6 Caspase-3活性檢測 采用ELISA法。取對數(shù)生長期細胞，待細胞貼壁后，將其分為5 μmol/L苦參堿組、10 μmol/L苦參堿組及對照組，分別加入5、10 μmol/L苦參堿和無菌PBS溶液作用24 h。加入胰酶消化，PBS洗滌。加入細胞裂解液震蕩裂解，4 ℃ 12 000 r/min離心，取上清。將pNA用反應(yīng)緩沖液稀釋為200、100、50、25、12.5、6.25、3.125 μmol/L，另設(shè)不加pNA的0管。每一濃度取100 μL加入96孔板，測定405 nm處OD值。每一濃度標準管OD405值為x軸，對應(yīng)的pNA濃度為y軸，用Excel軟件制作pNA濃度對應(yīng)OD405值的標準曲線。將60 μL待測樣品加入96孔板，加入5 μL底物，37 ℃反應(yīng)2 h，測定405 nm處的OD值。根據(jù)標準曲線計算Caspase-3活性。

1.7 AKT、mTOR、p70S6K、4EBP1蛋白活性檢測 采用Western blotting法。將MOVAS細胞接種于6孔板中，待細胞貼壁后，將其分為5 μmol/L苦參堿組、10 μmol/L苦參堿組及對照組，分別加入5、10 μmol/L苦參堿和無菌PBS溶液作用24 h。PBS洗滌，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的蛋白裂解液裂解細胞，離心后收集上清。用BCA法測各樣本的總蛋白濃度，加適量的上樣緩沖液在100 ℃金屬浴中煮5 min使蛋白變性。取50 μg總蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳后，轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用4%脫脂奶粉封閉1.5 h后，加入一抗，4 ℃孵育過夜。加入相應(yīng)的二抗，孵育2 h，用凝膠成像系統(tǒng)進行化學(xué)發(fā)光。用Image J軟件測量灰度值，以β-actin為內(nèi)參，分析目的蛋白的表達。以p-AKT、p-mTOR、p-p70S6K、p-4EBP1水平代表各蛋白活性。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞周期比較 與對照組比較，5 μmol/L和10 μmol/L苦參堿組G1期細胞比例升高(P均<0.01)，S期和G2期細胞比例降低(P均<0.05)。與5 μmol/L苦參堿組比較，10 μmol/L苦參堿組G1期細胞比例升高(P<0.01)，S期和G2期細胞比例降低(P均<0.05)。見表1。

表1 各組細胞周期比較

2.2 各組細胞凋亡率比較 對照組、5 μmol/L苦參堿組、10 μmol/L苦參堿組的細胞凋亡率分別為9.75%±1.23%、16.75%±2.02%、30.5%±1.73%。與對照組比較，5 μmol/L和10 μmol/L苦參堿組細胞凋亡率升高，且10 μmol/L組高于5 μmol/L組(P均<0.01)。

2.3 各組Caspase-3活性比較 對照組、5 μmol/L苦參堿組、10 μmol/L苦參堿組Caspase-3活性分別為743.33±103.46、1 043.33±97.57、1 816.67±143.19。與對照組比較，5 μmol/L和10 μmol/L苦參堿組Caspase-3活性升高，且10 μmol/L組高于5 μmol/L組(P均<0.05)。

2.4 各組AKT、mTOR、p70S6K、4EBP1蛋白活性比較 與對照組比較，5 μmol/L和10 μmol/L苦參堿組p-AKT、p-mTOR、p-p70S6K、p-4EBP1表達水平均降低，且10 μmol/L組低于5 μmol/L組(P均<0.05)。見表2。

表2 各組AKT、mTOR、p70S6K、4EBP1蛋白活性比較

3 討論

動脈粥樣硬化的進展涉及膽固醇代謝紊亂、泡沫細胞形成、慢性炎癥、血管平滑肌細胞增殖和遷移、內(nèi)皮功能障礙等病理過程。血管平滑肌細胞在動脈粥樣硬化形成的不同時期發(fā)揮不同的作用，包括表型轉(zhuǎn)換、細胞增殖、遷移、細胞凋亡和細胞衰老等。血管介入治療和外科手術(shù)治療后，血管平滑肌細胞受到刺激發(fā)生增殖，是新生內(nèi)膜形成的主要病理機制[8]。近年來，藥物洗脫支架常用來避免支架內(nèi)再狹窄的發(fā)生，但效果并不理想，接受藥物洗脫支架的患者和接受普通支架的患者6年病死率與自發(fā)性心肌梗死患者并無明顯差異。因此，為藥物洗脫支架尋找新的生物靶點是治療再狹窄的關(guān)鍵。苦參堿是從苦參中提取的生物堿，用于治療病毒性肝炎、心律失常和皮膚炎癥等疾病具有顯著效果。研究顯示，苦參堿能抑制年齡誘導(dǎo)的主動脈平滑肌細胞的表型轉(zhuǎn)換[9]。然而苦參堿對血管平滑肌細胞增殖和凋亡的影響目前少見報道。

程熠、耿婭等[10，11]報道，苦參堿對宮頸癌Hela細胞和正常肝細胞L-02細胞增殖具有抑制作用，其機制是通過阻斷細胞周期、誘導(dǎo)細胞凋亡來實現(xiàn)的。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，5 μmol/L和10 μmol/L苦參堿組G1期細胞比例增多，S期和G2期細胞比例減少。表明苦參堿能誘導(dǎo)MOVAS細胞周期發(fā)生停滯，從而抑制細胞增殖。

細胞凋亡包括線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性途徑和死亡受體誘導(dǎo)的外源性途徑。線粒體在細胞凋亡中起著中心作用。線粒體功能障礙時，線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)打開，細胞色素C從線粒體釋放至胞質(zhì)。細胞色素C的釋放對凋亡通路的執(zhí)行起重要作用，它激活了Caspase-9，隨后Caspase-3也被激活。Caspase-3是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，其活化導(dǎo)致目標細胞最終破壞[12]。本研究結(jié)果顯示，5 μmol/L和10 μmol/L苦參堿組的細胞凋亡率、Caspase-3活性均高于對照組，且10 μmol/L苦參堿組高于5 μmol/L苦參堿組。表明苦參堿能夠誘導(dǎo)MOVAS細胞凋亡，通過誘導(dǎo)MOVAS細胞周期阻滯和細胞凋亡來抑制新生內(nèi)膜形成，從而減少再狹窄的發(fā)生。

PI3K/AKT/mTOR信號通路在血管平滑肌細胞增殖和遷移中起關(guān)鍵作用，阻斷該信號通路可抑制平滑肌細胞增殖，促進其凋亡。研究證實，AKT失活可抑制多種類型細胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡[13]。本研究結(jié)果顯示，苦參堿可抑制MOVAS細胞中AKT的磷酸化。mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，由PI3K/AKT激活，參與細胞凋亡的調(diào)控。它調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的合成和降解、壽命和細胞骨架的形成。mTOR激活其下游效應(yīng)物4EBP1和p70S6K，進而翻譯促凋亡蛋白。通過這一途徑，mTOR也磷酸化并失活抗凋亡蛋白Bcl-2[14]。AKT/mTOR信號通路的阻斷在調(diào)節(jié)細胞凋亡中起關(guān)鍵作用，靶向mTOR可以抑制白血病細胞增殖，從而治療白血病[15]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)過苦參堿處理的MOVAS細胞中，AKT、mTOR及p70S6K、4EBP1的磷酸化失活。提示苦參堿誘導(dǎo)的MOVAS細胞凋亡可能是通過抑制AKT/mTOR信號通路發(fā)揮作用。

綜上所述，苦參堿能夠抑制血管平滑肌細胞增殖，阻滯細胞周期，并促進細胞凋亡；其機制可能與抑制AKT/mTOR信號通路有關(guān)。