lncRNA DLX6-AS1在宮頸癌組織中的表達(dá)及對宮頸癌細(xì)胞增殖和遷移能力的影響

王夢漪，陳莉，盧宏達(dá)，雷章

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院，武漢430014

宮頸癌是常見婦科腫瘤，嚴(yán)重威脅女性生命健康。目前宮頸癌的治療包括手術(shù)切除、放療和化療，多數(shù)患者的長期存活率仍不理想。分子靶向藥物在肺癌、乳腺癌等常見腫瘤的治療中已獲得較好的療效，但宮頸癌的治療仍缺乏有效的分子靶向藥物。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是指轉(zhuǎn)錄長度超過200個核苷酸的非編碼RNA，在細(xì)胞生長、分化和運(yùn)動等各種生理活動中發(fā)揮重要作用，其異常表達(dá)與腦血管疾病、心血管疾病、糖尿病和腫瘤等疾病密切相關(guān)[1～4]。無遠(yuǎn)端同源框6反義1(DLX6-AS1)是一種定位于7q21.3染色體區(qū)域的lncRNA，研究顯示，其在肺癌、胃癌、卵巢癌和肝癌等惡性腫瘤中具有促癌基因的作用[5～8]。但其在宮頸癌中的作用少見報道。2017年6月～2019年12月，我們通過檢測DLX6-AS1在宮頸癌組織中的表達(dá)變化，分析其與患者臨床病理特征的關(guān)系；進(jìn)一步干擾宮頸癌Hela細(xì)胞中DLX6-AS1的表達(dá)，觀察其對細(xì)胞增殖和遷移能力的影響，并從Wnt/β-catenin信號通路的角度探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 宮頸癌組織標(biāo)本來源 收集2017年1月～2019年1月在我院行穿刺或手術(shù)切除的宮頸癌患者50例，年齡29～72(59.44±18.67)歲。均經(jīng)病理檢查確診為宮頸癌。患者未行放化療等治療，不合并其他腫瘤或影響生存期的全身疾病。收集手術(shù)或穿刺標(biāo)本組織，-80 ℃保存。取同期因良性疾病手術(shù)獲得的正常宮頸組織30例作為對照組。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

1.1.2 細(xì)胞與試劑 宮頸癌HeLa細(xì)胞購自美國ATCC細(xì)胞庫。DLX6-AS1、內(nèi)參GAPDH引物購自中國上海捷瑞生物工程有限公司；TRIzol、PrimeScriptTMRT reagent Kit逆轉(zhuǎn)錄和SYBR Premix Ex TaqTMPerfect Real time實(shí)時熒光定量(qRT-PCR)試劑盒購于日本TaKaRa公司；DMEM-高糖培養(yǎng)基、FBS購于美國Gibco公司；DLX6-AS1干擾RNA購于廣州銳博生物科技有限公司；MTS試劑購于美國Promega公司；Transwell購于美國Thermo公司；BCA蛋白濃度檢測試劑盒購于美國Thermo公司。

1.2 DLX6-AS1表達(dá)檢測 采用qRT-PCR法。TRIzol裂解液加入組織中充分裂解，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA作為模板，按qRT-PCR試劑盒操作說明書配制反應(yīng)體系。DLX6-AS1引物：上游5′-AGTTTCTCTCTAGATTGCCTT-3′，下游5′-ATTGACATGTTAGTGCCCTT-3′。GAPDH引物：上游5′-GGGAAATTCAACGGCACAGT-3′，下游 5′-AGATGGTGATGGGCTTCCC-3′。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 s，95 ℃變性5 s、60 ℃退火30 s，40個循環(huán)。上機(jī)進(jìn)行熒光定量PCR。以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達(dá)量。

1.3 干擾DLX6-AS1表達(dá)對宮頸癌細(xì)胞增殖和遷移能力的影響觀察

1.3.1 細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染 取HeLa細(xì)胞，加入含有10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞，加入胰酶消化，按2×105/孔接種至6孔板。待細(xì)胞貼壁后，將細(xì)胞分為干擾對照組(si-NC組)和si-DLX6-AS1組。按照說明書方法將NC siRNA與脂質(zhì)體2000混勻后加至si-NC組，DLX6-AS1 siRNA與脂質(zhì)體2000混勻后加至si-NC組，轉(zhuǎn)染48 h。DLX6-AS1干擾siRNA序列，si-DLX6-AS1#1：5′-GGAAAGAAGAGATTAGAAGAA-3′，si-DLX6-AS1#2：5′-AAGGCCACTGCATATGAGTTG-3′，si-DLX6-AS1#3：5′-GATTTCTAAACCCTGATCATT-3′。

1.3.2 細(xì)胞增殖能力觀察 采用MTS實(shí)驗(yàn)。取對數(shù)生長期細(xì)胞，加入胰酶消化，以2×103/孔接種至96孔板。待細(xì)胞貼壁后，將細(xì)胞分為si-NC組和si-DLX6-AS1組，按照“1.3.1”的步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染，每組設(shè)6個復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后，每孔加入30 μL MTS工作液，37 ℃避光孵育2 h。上酶標(biāo)儀，于波長490 nm處檢測吸光度(A)值。細(xì)胞增殖率=(1-si-DLX6-AS1組A值/si-NC組A值)×100%。

1.3.3 細(xì)胞遷移能力觀察 采用Transwell實(shí)驗(yàn)。按照“1.3.2”的步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染，每組設(shè)6個復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后，胰酶消化收集細(xì)胞，洗去FBS，用無血清培養(yǎng)基將細(xì)胞制成1×105/mL的細(xì)胞懸液，取100 μL接種于Transwell小室的上室，下室加入含10% FBS的500 μL培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中。顯微鏡下觀察細(xì)胞由上室經(jīng)微孔膜穿入下室的情況，穿入下室細(xì)胞10個左右時終止培養(yǎng)，用PBS洗去微孔膜上室面細(xì)胞，甲醇固定，蘇木素染色，計數(shù)微孔膜下室面細(xì)胞數(shù)，以細(xì)胞數(shù)目代表細(xì)胞遷移能力。

1.3.4 細(xì)胞β-catenin蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting法。按照“1.3.2”的步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)48 h后，胰酶消化收集細(xì)胞。加入蛋白裂解液完全裂解，4 ℃、14 000 r/min離心20 min，取上清液，BCA試劑盒檢測蛋白濃度。行SDS-PAGE電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)，5% BSA室溫封閉1 h，TBST洗滌3次，加入一抗稀釋液(稀釋比為1∶500)4 ℃孵育過夜。TBST洗滌3次，加入兔二抗(稀釋比為1∶10 000)室溫孵育2 h，ELC化學(xué)發(fā)光法曝光條帶。采用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度比值表示目的蛋白的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌組織與正常宮頸組織中DLX6-AS1表達(dá)比較 宮頸癌組織中DLX6-AS1的相對表達(dá)量為2.07±0.83，正常宮頸組織為1.04±0.36，DLX6-AS1在宮頸癌組織中的表達(dá)高于正常宮頸組織(t=6.407，P=0.021)。

2.2 不同臨床病理特征患者宮頸癌組織中DLX6-AS1表達(dá)水平比較 TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者宮頸癌組織中DLX6-AS1表達(dá)水平高于TNM分期Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者(P均<0.05)，不同年齡、腫瘤直徑、組織學(xué)分級患者的DLX6-AS1表達(dá)水平無統(tǒng)計學(xué)差異(P均>0.05)。見表1。

表1 不同臨床病理特征患者宮頸癌組織中DLX6-AS1表達(dá)水平比較

2.3 干擾DLX6-AS1表達(dá)對宮頸癌細(xì)胞增殖和遷移能力的影響結(jié)果

2.3.1 兩組細(xì)胞增殖能力比較 si-NC組細(xì)胞增殖率為100.14%±1.57%，si-DLX6-AS1組為31.62%±5.45%，si-DLX6-AS1組細(xì)胞增殖率較si-NC組降低(t=20.93，P=0.000)。

2.3.2 兩組細(xì)胞遷移能力比較 si-NC組穿膜細(xì)胞數(shù)為(112.54±11.57)個，si-DLX6-AS1組為(53.24±8.64)個，si-DLX6-AS1組穿膜細(xì)胞數(shù)較si-NC組減少(t=7.133,P=0.001)。

2.3.3 兩組β-catenin蛋白表達(dá)水平比較 si-NC組β-catenin蛋白表達(dá)水平為0.78±0.19，si-DLX6-AS1組為0.30±0.13。si-DLX6-AS1組β-catenin蛋白表達(dá)較si-NC組減少(t=3.611，P=0.015)。

3 討論

宮頸癌是嚴(yán)重威脅女性生命健康的惡性腫瘤之一。宮頸癌發(fā)病的危險因素包括人乳頭瘤病毒感染、性生活過早、吸煙以及衛(wèi)生條件差等，因此宮頸癌發(fā)病率及病死率存在地域差異，發(fā)展中國家發(fā)病率的病死率普遍高于發(fā)達(dá)國家。研究顯示，宮頸癌早期未發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移時，手術(shù)切除的預(yù)后較好，然而由于早期癥狀隱匿，患者確診時常為晚期，失去手術(shù)機(jī)會。腫瘤的發(fā)生機(jī)制錯綜復(fù)雜，目前宮頸癌的發(fā)病機(jī)制仍然未明確，因此探索宮頸癌發(fā)病的潛在分子機(jī)制有助于為宮頸癌的治療提供新的策略。新近研究表明，lncRNA參與調(diào)控轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾、核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、染色質(zhì)修飾和X染色體沉默等各種重要的生理過程[9]，其參與調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用已成為研究熱點(diǎn)。DLX基因家族是遠(yuǎn)端無果蠅基因的脊椎動物同源物，該家族包含參與細(xì)胞分化和形態(tài)發(fā)生的同源框轉(zhuǎn)錄因子家族，分為DLX1～6，在人類實(shí)體瘤和血液學(xué)腫瘤中均發(fā)現(xiàn)DLX家族表達(dá)失調(diào)[10]。DLX6-AS1是DLX基因家族成員的調(diào)節(jié)因子，與肺癌、胃癌、卵巢癌、肝癌等腫瘤密切相關(guān)[5～8]，但DLX6-AS1與宮頸癌的關(guān)系目前尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，DLX6-AS1在宮頸癌組織中的表達(dá)顯著高于正常宮頸組織，提示其在宮頸癌中高表達(dá)可能具有致癌性。

研究顯示，DLX6-AS1在非小細(xì)胞肺癌中高表達(dá)與患者的腫瘤直徑和晚期臨床分期有關(guān)[5]，在胃癌中表達(dá)增加與患者晚期臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)[6]，在上皮性卵巢癌中表達(dá)上調(diào)與患者FIGO分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)[7]。本研究結(jié)果顯示，DLX6-AS1在宮頸癌組織中的表達(dá)水平與患者TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，而與患者年齡、腫瘤直徑、組織學(xué)分級無關(guān)。提示DLX6-AS1可能促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。

Sun等[5]報道，下調(diào)DLX6-AS1表達(dá)可抑制非小細(xì)胞肺癌的細(xì)胞增殖、克隆形成以及遷移、侵襲能力。DLX6-AS1的沉默顯示抑制肝癌腫瘤球形成、集落形成、增殖和腫瘤形成能力[8]。本研究采用siRNA技術(shù)干擾HeLa細(xì)胞中DLX6-AS1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖和遷移能力下降，表明DLX6-AS1在宮頸癌生長和轉(zhuǎn)移過程中具有重要作用。

惡性增殖和轉(zhuǎn)移是腫瘤的兩大重要特征，MAPK、PI3K/AKT、Wnt/β-catenin通路是調(diào)控腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移的重要信號通路[11～13]。Yang等[14]報道，DLX6-AS1可通過miR-497-5p/FZD4/FZD6/Wnt/β-catenin信號通路促進(jìn)胰腺癌發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，抑制Hela細(xì)胞中DLX6-AS1表達(dá)后，Wnt信號通路關(guān)鍵分子β-catenin蛋白的表達(dá)水平降低。表明DLX6-AS1可能通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，DLX6-AS1在宮頸癌組織中表達(dá)升高，與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)；干擾DLX6-AS1表達(dá)可能通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖和侵襲。