基于GEO數(shù)據(jù)庫對(duì)慢性乙型肝炎中關(guān)鍵miRNAs篩選及其生物信息學(xué)分析

王慶輝，錢惠忠，張媛媛，夏衛(wèi)，劉曉，郝慶欽

無錫市中心血站，江蘇無錫214000

慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染是重大的全球性公共衛(wèi)生問題，具有較高的發(fā)病率和病死率[1,2]。由于HBV感染的發(fā)生發(fā)展過程較復(fù)雜，慢性乙型肝炎(CHB)的發(fā)病機(jī)制仍未闡明。miRNAs是一類長(zhǎng)度為21～25 nt的非編碼RNA，通過與mRNA靶向結(jié)合調(diào)控相應(yīng)蛋白表達(dá)水平，在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中起到重要調(diào)節(jié)作用[3]。近年研究表明，在HBV感染的過程中存在特征性的miRNAs表達(dá)譜并發(fā)揮重要作用，與病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄、疾病進(jìn)展和預(yù)后密切相關(guān)[4]。2020年1～3月，我們借助生物信息學(xué)技術(shù)深入挖掘CHB患者肝組織miRNAs表達(dá)譜，初步探索其在CHB發(fā)生、發(fā)展中的潛在作用機(jī)制，為CHB發(fā)病機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究和將來治療靶點(diǎn)的選擇提供數(shù)據(jù)和基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源 從GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)檢索下載CHB患者miRNAs表達(dá)芯片數(shù)據(jù)，納入標(biāo)準(zhǔn)：①研究對(duì)象包含CHB患者和正常對(duì)照；②樣品為人肝臟組織；③研究類型為“Non-coding RNA profiling by array”。最終篩選出GSE110217芯片數(shù)據(jù)，該芯片采用GPL15018平臺(tái)(Agilent-031181 Unrestricted_Human_miRNA_V16.0_ Microarray030840)，包含42個(gè)肝組織樣本，其中8個(gè)接受治療前的CHB患者和4個(gè)正常肝臟組織樣本數(shù)據(jù)被提取進(jìn)行進(jìn)一步研究。

1.2 差異表達(dá)的miRNAs的篩選 在R軟件環(huán)境下應(yīng)用limma軟件包對(duì)矩陣數(shù)據(jù)進(jìn)行校正標(biāo)準(zhǔn)化和log2轉(zhuǎn)換，當(dāng)多個(gè)探針對(duì)應(yīng)到一個(gè)miRNA時(shí)，取多個(gè)探針的均值作為其相應(yīng)的表達(dá)值。最后以差異倍數(shù)(FC)≥2、錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)<0.05作為標(biāo)準(zhǔn)，篩選差異表達(dá)的miRNAs。

1.3 miRNAs靶基因預(yù)測(cè) 從miRDB(http://mirdb.org/)、miRTarBase(http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php)和TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_72/)下載比對(duì)數(shù)據(jù)庫。借助Perl腳本，提取同時(shí)在這3種數(shù)據(jù)庫比對(duì)成功的基因?yàn)閙iRNAs靶基因。

1.4 靶基因生物學(xué)功能和信號(hào)通路富集分析 采用DAVID在線數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)對(duì)目的基因進(jìn)行生物學(xué)功能(GO)分析；同時(shí)利用京都基因與基因組百科全書(KEGG)數(shù)據(jù)庫對(duì)基因進(jìn)行生物通路富集分析。以P<0.01為標(biāo)準(zhǔn)，篩選靶基因所涉及的有意義的生物學(xué)功能和通路。

1.5 靶基因蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)分析 String(https://string-db.org/)是利用已知或預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)組成的數(shù)據(jù)庫，包括直接和間接的蛋白質(zhì)間相互作用。通過此數(shù)據(jù)庫對(duì)靶基因進(jìn)行相互作用網(wǎng)絡(luò)分析，并借助Cytoscape軟件進(jìn)行可視化，數(shù)據(jù)設(shè)置條件為評(píng)分>0.9。進(jìn)一步利用Cytohubba插件對(duì)靶基因自由度(Degree)進(jìn)行計(jì)算，篩選關(guān)鍵基因。

1.6 miRNAs的轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)和富集分析 通過Transmir 2.0(http://www.cuilab.cn/transmir)數(shù)據(jù)庫在線預(yù)測(cè)和富集分析，以P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選。迄今為止，Transmir 2.0數(shù)據(jù)庫包含由1 394篇文獻(xiàn)驗(yàn)證的3 730對(duì)轉(zhuǎn)錄因子-miRNAs和1 785 998對(duì)ChIP-seq來源的轉(zhuǎn)錄因子-miRNAs，通過該數(shù)據(jù)庫可以識(shí)別轉(zhuǎn)錄因子和miRNAs之間的關(guān)聯(lián)。

1.7 轉(zhuǎn)錄因子-miRNAs-靶基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析 以富集在乙型肝炎(hsa05161)通路上的靶基因?yàn)榛A(chǔ)，篩選相應(yīng)的差異表達(dá)的miRNAs，并對(duì)這些miRNAs進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測(cè)和富集分析，最終構(gòu)建富集的轉(zhuǎn)錄因子-miRNAs-靶基因的調(diào)控關(guān)系網(wǎng)絡(luò)并可視化。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)的miRNAs和mRNA篩選分析結(jié)果 通過R語言分析，GSE110217中有33個(gè)miRNAs差異性表達(dá)，其中10個(gè)表達(dá)上調(diào)，23個(gè)表達(dá)下調(diào)，見表1。

表1 GSE110217中33個(gè)miRNAs在CHB差異表達(dá)特征

2.2 miRNAs靶基因預(yù)測(cè)及生物功能富集分析結(jié)果 33個(gè)差異表達(dá)的miRNAs的靶基因經(jīng)miRDB、miRTarBase、TargetScan數(shù)據(jù)庫進(jìn)行預(yù)測(cè)，取交集共得到747個(gè)靶基因。進(jìn)一步應(yīng)用生物信息學(xué)手段對(duì)上述靶基因進(jìn)行功能注釋富集分析，結(jié)果見表2。GO分析顯示，靶基因主要涉及轉(zhuǎn)錄調(diào)控、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的調(diào)控、細(xì)胞分裂、凋亡過程負(fù)調(diào)控、細(xì)胞黏附等生物學(xué)過程。KEGG分析顯示，靶基因主要富集在乙型肝炎、人類嗜T淋巴細(xì)胞病毒Ⅰ型感染以及PI3K/AKT、FoxO、Hippo信號(hào)通路等。其中有21個(gè)靶基因富集在乙型肝炎通路中，分別為PRKCA、YWHAZ、MAP2K4、SMAD4、YWHAB、TIRAP、ELK1、FASLG、BIRC5、CDK6、DDX58、CCNE2、NRAS、CCND1、DDX3X、YWHAQ、PCNA、JAK1、MAPK8、IKBKB和NFATC3。

表2 差異表達(dá)的miRNAs的靶基因生物學(xué)功能和通路富集分析前10位情況

2.3 miRNAs靶基因PPI分析結(jié)果 在構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)中，依據(jù)蛋白間相互作用程度(Degree≥19)，從中共鑒定出16個(gè)核心靶基因，依次為CDC5L、GTF2F1、UBE2D1、NRAS、ESR1、CBFB、SOCS3、NR3C1、MAPK8、PRKCA、RNF111、SMAD4、FBXL、FN1、YWHAB和SMAD3。主要富集在RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的調(diào)控、TGF-β2生成的調(diào)節(jié)、SMAD蛋白復(fù)合體的形成及蛋白泛素化等生物學(xué)過程，以及乙型肝炎通路和PI3K-AKT、FoxO、Hippo等信號(hào)通路。其中有5個(gè)核心靶基因涉及在乙型肝炎通路中，分別為MAPK8、SMAD4、YWHAB、NRAS和PRKCA。

2.4 轉(zhuǎn)錄因子-miRNAs-靶基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建結(jié)果 如圖1，共有21個(gè)靶基因涉及乙型肝炎通路，其中PRKCA、SMAD4、YWHAB、NRAS、MAPK8也是PPI網(wǎng)絡(luò)中核心靶基因。涉及的miRNAs分別為hsa-miR-218、-363、-30b、-513a-5p、-3652、-1、-214*、-145、-542-3p、-502-3p，其中hsa-miR-218可調(diào)控此通路中的6個(gè)基因。另外，這10個(gè)miRNAs的富集轉(zhuǎn)錄因子共25個(gè)，其中USF1核心作用明顯。

注：菱形為miRNAs的富集的轉(zhuǎn)錄因子，長(zhǎng)方形為miRNAs,橢圓形為靶基因

3 討論

CHB是慢性HBV感染的一個(gè)階段，可進(jìn)展為肝硬化、肝衰竭、肝細(xì)胞癌等嚴(yán)重肝臟疾病[5]。目前CHB的治療藥物主要包括聚乙二醇干擾素和核苷酸類似物，然而由于患者體內(nèi)病毒cccDNA的持續(xù)存在，以及機(jī)體對(duì)HBV持續(xù)強(qiáng)有力的免疫功能的缺乏，療效仍不理想[6]。因此，為進(jìn)一步提高療效，改善患者預(yù)后，亟待闡明CHB的發(fā)病機(jī)制。近年研究表明，miRNAs在HBV感染相關(guān)疾病中的異常表達(dá)與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[7，8]。一方面，機(jī)體miRNAs可以通過直接與HBV轉(zhuǎn)錄本結(jié)合或間接靶向于HBV生命周期相關(guān)的細(xì)胞因子，從而調(diào)控HBV轉(zhuǎn)錄和復(fù)制[9]；另一方面，HBV感染可干擾宿主miRNAs表達(dá)，導(dǎo)致相應(yīng)靶基因的功能失調(diào)[7，10]；此外，HBV也可編碼miRNAs(HBV-miR-3)，調(diào)控自身的生命活動(dòng)[11]。然而miRNAs在CHB發(fā)生發(fā)展中的潛在作用機(jī)制仍不清楚。

本研究利用GEO數(shù)據(jù)庫中的CHB的miRNAs芯片表達(dá)數(shù)據(jù)，篩選出33個(gè)差異表達(dá)的miRNAs，并通過預(yù)測(cè)獲得747個(gè)靶基因。生物過程分析提示，差異表達(dá)的miRNAs主要參與RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的調(diào)控，細(xì)胞分裂、凋亡過程負(fù)調(diào)控及細(xì)胞黏附等生物過程；通路分析顯示，主要涉及乙型肝炎通路和PI3K/AKT、FoxO、Hippo信號(hào)通路等。隨后通過PPI網(wǎng)絡(luò)分析篩出16個(gè)核心靶基因，功能富集分析顯示，同樣涉及乙型肝炎通路和PI3K/AKT、FoxO和Hippo等信號(hào)通路。這些結(jié)果提示，miRNAs可能通過乙型肝炎通路在CHB發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，本研究涉及的此通路中21個(gè)靶基因中，5個(gè)為PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心靶基因，分別為MAPK8、SMAD4、YWHAB、NRAS和PRKCA。因此，我們推測(cè)這5個(gè)基因在CHB的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮重要作用。

MAPK信號(hào)通路是在機(jī)體對(duì)外來微生物固有免疫應(yīng)答中一重要通路，其中MAPK8不僅可通過促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化上調(diào)促炎癥的細(xì)胞因子和趨化因子表達(dá)，同時(shí)也可以調(diào)控輔助性T細(xì)胞(Th)向Th1分化[12]。Cao等[13]研究發(fā)現(xiàn)，MAPK8的多態(tài)性可影響著Th1介導(dǎo)的抗HBV細(xì)胞免疫應(yīng)答，并導(dǎo)致抗HBsAg抗體的產(chǎn)生。SMAD4是TGF-β信號(hào)通路中一個(gè)重要因子，其包含一個(gè)核定位信號(hào)，能充當(dāng)細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)之間交流載體。據(jù)報(bào)道，miR-34a-5p可以靶向TGF-β信號(hào)通路中SMAD4介導(dǎo)肝纖維化[14]。另外，Smad4也是一個(gè)被HBx調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子，HBx通過Smad4可上調(diào)NUPR1表達(dá)，后者可抑制肝細(xì)胞的凋亡和誘導(dǎo)血管生成擬態(tài)，促進(jìn)腫瘤生成。然而，目前尚無PRKCA、YWHAB和NRAS在HBV感染性疾病中的相關(guān)報(bào)道。

最后，考慮到乙型肝炎通路在CHB發(fā)生發(fā)展過程中的重要作用，我們選取此通路中本研究涉及的21個(gè)靶基因?yàn)榛鶞?zhǔn)，構(gòu)建轉(zhuǎn)錄因子-miRNAs-靶基因調(diào)控關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而探討CHB中關(guān)鍵miRNAs及其潛在的分子作用機(jī)制。結(jié)果顯示，有10個(gè)miRNAs，即hsa-miR-218、-363、-30b、-513a-5p、-3652、-1、-214*、-145、-542-3p、-502-3p可能通過調(diào)控乙型肝炎通路中的基因參與CHB的發(fā)生發(fā)展，其中以hsa-miR-218的作用最具有多樣性。在上述miRNAs中，miR-1、-218、-30b、-214-3p、-145已被研究報(bào)道可能與HBV感染相關(guān)性疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。Zhang等[15]報(bào)道，miR-1可促進(jìn)HBV的復(fù)制、子代病毒分泌和抗原表達(dá)，其機(jī)制主要是通過增強(qiáng)FXRA表達(dá)、增強(qiáng)HBV核心啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性，從而增強(qiáng)HBV復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。Han等[16]報(bào)道，miR-218啟動(dòng)子rs11134527不僅可增加HCC患病的風(fēng)險(xiǎn)，而且與男性體內(nèi)HBV preS缺失密切相關(guān)；其與HBV基因T1674C/G及preS1起始密碼突變相互作用可影響肝細(xì)胞癌變的進(jìn)程。Chen等[17]報(bào)道，IL-6R在CHB肝硬化患者中表達(dá)上調(diào)，而miR-30b表達(dá)下調(diào)，miR-30b可直接靶向調(diào)節(jié)IL-6R，參與慢性HBV感染后肝纖維化進(jìn)程。Chen等[18]利用芯片檢測(cè)技術(shù)在CHB伴纖維化患者的肝組織中共鑒定出105個(gè)差異表達(dá)的miRNAs，其中hsa-miR-214-3p能夠最高效地區(qū)分肝纖維化，并與肝組織臟炎癥程度相關(guān)。Gao等[19]研究顯示，HBV感染可通過HBx蛋白下調(diào)miR-145的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致靶基因CUL5的表達(dá)上調(diào)，最終促進(jìn)肝細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖。目前尚無hsa-miR-363、-513a-5p、-3652、-542-3p、-502-3p在HBV感染性疾病中的相關(guān)報(bào)道，但其在CHB中的作用同樣值得研究。

本研究的不足之處在于：首先，經(jīng)篩選符合條件的肝組織miRNAs表達(dá)芯片有限，并且納入的組織樣本量較少，對(duì)研究結(jié)果可能會(huì)造成一定偏倚；其次，篩選出的關(guān)鍵miRNAs及參與調(diào)控的通路僅是通過生物信息學(xué)方法獲得，仍需后期進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上所述，本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)篩選出在CHB患者肝組織中差異表達(dá)的miRNAs，隨后通過對(duì)靶基因富集分析探討這些miRNAs參與調(diào)控的生物過程及相關(guān)信號(hào)通路，并進(jìn)一步從中篩選具有核心功能的miRNAs，構(gòu)建以其為核心的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從而更好地解析CHB發(fā)病過程中關(guān)鍵miRNAs及其潛在的分子作用機(jī)制途徑，為后期實(shí)驗(yàn)研究和CHB新治療靶點(diǎn)的選擇提供數(shù)據(jù)和理論基礎(chǔ)。