二甲雙胍對肝癌細胞凋亡及PI3K/AKT/mTOR信號通路的影響

陶荔，曹鶯

蘇州大學附屬張家港醫院，江蘇張家港215600

肝癌起病隱匿，大多數患者發現時已是中晚期，失去手術機會。流行病學研究顯示，糖尿病與肝癌的發生發展有關，糖尿病患者發生肝癌的風險是正常人群的2～3倍，同時，合并糖尿病的肝癌患者腫瘤轉移更快、預后更差[1，2]。二甲雙胍是治療2型糖尿病的一線藥物，研究發現，二甲雙胍能夠降低2型糖尿病患者乳腺癌、肝癌、胰腺癌等的發病率[3，4]，并改善惡性腫瘤患者預后[5，6]，提示二甲雙胍具有潛在的抗腫瘤作用。2017年9月～2019年12月，我們觀察了二甲雙胍對肝癌細胞增殖和凋亡的影響，并探討其可能的分子機制，為二甲雙胍用于肝癌治療提供理論依據。

1 材料

1.1 細胞、試劑與儀器 人肝癌SMMC-7721細胞株購自上海中科院細胞庫。二甲雙胍(上海碧云天生物技術有限公司)，RPMI-1640培養基(Corning公司)，胎牛血清(美國Gibco公司)，MTT(北京索萊寶科技有限公司)，AnnexinⅤ-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(美國BD公司)，凋亡相關蛋白Bax抗體(美國Cell Signaling公司)、Bcl-2抗體(Abcam公司)，PI3K/AKT/mTOR信號通路相關蛋白AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR抗體以及內參蛋白α-Tublin抗體(美國Cell Signaling公司)。Varioskan Flash酶標儀(美國Thermo公司)，FACS Calibur流式細胞儀(美國BD公司)。

1.2 細胞培養 將SMMC-7721細胞加入含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素的RMPI-1640培養基，37 ℃、5% CO2培養箱中培養。待細胞密度達到80%后進行傳代，取對數生長期細胞進行后續實驗。

1.3 二甲雙胍最佳作用濃度和時間的篩選 采用MTT法。取對數生長期細胞，加入0.25%胰蛋白酶消化，制備單細胞懸液，調整細胞密度為1×105/mL，按100 μL/孔接種于96孔板中，培養箱中培養24 h。待細胞貼壁后，棄培養基，分別加入5、10、20、40、80 mmol/L二甲雙胍分別處理24 h、48 h，每個濃度設置3個復孔，另設對照組，加入同體積的培養基。加入0.5% MTT溶液繼續培養4 h，加入100 μL二甲基亞砜振蕩15 min，至藍色晶體完全溶解。用酶標儀在570 nm波長處測定吸光度(A)值。細胞存活率=實驗組A值/對照組A值×100%。根據不同濃度下的細胞存活率(表1)，計算二甲雙胍作用于細胞24、48 h的IC50值分別為36.05、25.76 mmol/L。根據細胞存活率及IC50結果，綜合評價藥物效果與細胞毒性后，采用5、10、20 mmol/L二甲雙胍處理48 h進行后續實驗。

表1 不同濃度二甲雙胍作用24、48 h的細胞存活率

1.4 細胞凋亡檢測 采用流式細胞術。取對數生長期細胞，加入0.25%胰蛋白酶消化，制備單細胞懸液，調整細胞密度為1×105/mL，按2 mL/孔接種于6孔板中，培養箱中培養24 h。待細胞貼壁后，棄培養基，將細胞分為二甲雙胍組和對照組，二甲雙胍組分別加入5、10、20 mmol/L二甲雙胍處理48 h，對照組加入同體積的培養基。收集各組細胞，用預冷的PBS沖洗3次，離心棄上清，加入Annexin Ⅴ-FITC結合液重懸，再加入PI染色液混勻，避光孵育15 min，上流式細胞儀檢測。

1.5 凋亡相關蛋白以及PI3K/AKT/mTOR信號通路蛋白表達檢測 采用Western blotting法。取對數生長期細胞，加入0.25%胰蛋白酶消化，制備單細胞懸液，調整細胞密度為2.5×105/mL，按2 mL/孔接種于6孔板中，培養箱中培養24 h。待細胞貼壁后，棄培養基，將細胞分為二甲雙胍組和對照組，二甲雙胍組分別加入5、10、20 mmol/L二甲雙胍處理48 h，對照組加入同體積的培養基。收集細胞，加入含有蛋白酶抑制劑的細胞裂解液于冰上裂解20 min，離心，收集上清液，用BCA法進行蛋白定量。取40 μg蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，然后將蛋白轉印到PVDF膜上，用5%的脫脂牛奶室溫封閉1.5 h。分別加入一抗(Bax、Bcl-2稀釋倍數為1∶500，AKT、mTOR、p-AKT、p-mTOR稀釋倍數為1∶1 000，α-Tublin稀釋倍數為1∶5 000)4 ℃孵育過夜。TBST洗滌3次，加入二抗室溫孵育2 h。TBST洗滌3次，使用ECL發光顯影。圖像采用Image J軟件進行灰度分析。以目的蛋白條帶灰度值與內參α-Tublin灰度值的比值表示蛋白相對表達量。以Bcl-2/Bax比值表示細胞凋亡程度，以p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR表示蛋白磷酸化水平。

2 結果

2.1 各組細胞凋亡率比較 對照組及二甲雙胍組5、10、20 mmol/L作用48 h后的細胞凋亡率分別為4.23%±0.49%、16.71%±1.64%、20.61%±2.48%、30.78±1.11%，二甲雙胍組不同濃度作用后的細胞凋亡率均高于對照組(P<0.05或<0.01)。

2.2 各組細胞Bax、Bcl-2蛋白表達比較 與對照組比較，二甲雙胍組5 mmol/L作用后Bax蛋白表達水平無統計學差異(P>0.05)，二甲雙胍組10、20 mmol/L作用后Bax蛋白表達升高(P均<0.05)；二甲雙胍組不同濃度作用后Bcl-2蛋白表達水平、Bcl-2/Bax均降低(P<0.05或<0.01)。見表2。

表2 各組細胞Bax、Bcl-2蛋白表達水平比較

2.3 各組細胞p-AKT、p-mTOR蛋白表達比較 與對照組相比，二甲雙胍組p-AKT、p-mTOR蛋白表達水平均降低(P<0.05或P<0.01)。見表3。

表3 各組細胞p-AKT、p-mTOR蛋白表達水平比較

3 討論

原發性肝癌是常見的消化道惡性腫瘤之一。據統計，全球每年約有70萬以上的人死于肝癌，而中國的肝癌患者占其中一半以上。目前肝癌的治療包括放化療、介入化療栓塞、射頻消融、靶向和免疫藥物治療等綜合治療，但仍不能有效預防其復發和轉移[7]。以索拉菲尼為代表的靶向藥物在肝癌的治療方面取得了一定的療效，但是長期使用容易產生耐受并導致嚴重不良反應[8]，影響患者的生活質量以及預后。因此，尋找安全有效的藥物是肝癌治療中亟待解決的問題。

二甲雙胍是雙胍類口服降糖藥，通過減少肝糖原異生，增加周圍組織對胰島素的敏感性，并抑制腸道組織對葡萄糖的攝取發揮降血糖作用。2型糖尿病患者發生惡性腫瘤如乳腺癌、結腸癌、肝癌、子宮內膜癌、胰腺癌等的風險高于正常人群，其原因可能與2型糖尿病中胰島素抵抗、高胰島素血癥、糖脂代謝紊亂以及胰島素樣生長因子1水平升高有關[9]。體內外實驗表明，二甲雙胍能夠抑制多種惡性腫瘤如乳腺癌[3]、胰腺癌[5]、子宮內膜癌[10]、肺癌[11]的生長。其抗腫瘤作用機制包括兩方面：①直接作用：二甲雙胍直接作用于腫瘤細胞，引起細胞周期阻滯或者細胞凋亡，最終抑制腫瘤的生長;②間接作用：二甲雙胍通過改善胰島素抵抗，調節胰島素/胰島素樣生長因子1軸抑制腫瘤細胞的增殖，降低腫瘤發生的風險。

糖尿病是肝癌發生的高風險因素之一。Wang等[12]的Meta分析表明，糖尿病患者發生肝癌的風險顯著高于正常人群；另有研究顯示，服用二甲雙胍的糖尿病患者肝癌發生率明顯降低，并且二甲雙胍能夠降低肝癌相關病死率[13，14]。這提示二甲雙胍對肝癌的發生發展具有抑制作用，但具體作用機制尚不明確。本研究結果顯示，5、10、20 mmol/L二甲雙胍作用于肝癌細胞24、48 h后，細胞存活率均低于對照組。這表明二甲雙胍能夠抑制肝癌細胞增殖，促進其凋亡，從而抑制肝癌的進展。

腫瘤的發生發展是一個由多種信號通路共同作用的復雜過程，而細胞凋亡途徑是腫瘤形成過程中的重要環節。細胞凋亡是一種程序性死亡，是由相關基因調控的。目前研究的與腫瘤凋亡密切相關的基因有Bcl-2、Caspases家族等，其中Bcl-2家族在線粒體介導的細胞凋亡過程中起著關鍵作用;Bax是促凋亡蛋白，通過調節細胞線粒體膜的通透性，促進細胞色素C的釋放，激活Caspase級聯反應，最終導致細胞凋亡。Bcl-2是抗凋亡蛋白，與Bax相反，通過阻止細胞色素C的釋放從而抑制細胞凋亡[15]。在很多腫瘤細胞中，由于Bcl-2家族促凋亡蛋白減少，抗凋亡蛋白表達升高，導致細胞凋亡減少，因此調節Bcl-2和Bax等相關凋亡蛋白的表達，誘導腫瘤細胞凋亡，能夠有效地抑制腫瘤的生長。另外，Bcl-2/Bax也能反映細胞凋亡程度，Bcl-2/Bax上調表明抑制細胞凋亡，Bcl-2/Bax下調表明促進細胞凋亡[16]。本研究結果顯示，不同濃度二甲雙胍作用于肝癌細胞后，Bcl-2蛋白表達水平降低，Bax蛋白表達水平升高，Bcl-2/Bax降低，表明二甲雙胍能夠通過調控凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax的表達，誘導肝癌細胞凋亡。

隨著對腫瘤的研究逐步深入，多種信號通路被發現參與到腫瘤的發生發展中，其中PI3K/AKT/mTOR信號通路在肺癌、肝癌等多種腫瘤中均被激活，在腫瘤細胞增殖和凋亡過程中起重要作用[17]。PI3K是一種存在于細胞質的脂類激酶，可以催化磷酯酰肌醇D3位的磷酸化。AKT是高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是PI3K的下游蛋白之一，激活的磷酸化AKT具有促進細胞增殖、抗凋亡的作用。mTOR屬于PI3K蛋白激酶類家族，也是PI3K信號通路下游分子之一。研究表明，激活的PI3K/AKT信號通路可以通過影響Bcl-2家族來抑制細胞凋亡，進而促進細胞增殖[18]。mTOR信號通路激活與肝癌的發生發展有著密切聯系。在一項胰腺癌的研究中發現，二甲雙胍能夠抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路，從而抑制胰腺癌細胞增殖，促進其凋亡[19]。本研究結果顯示，不同濃度二甲雙胍用于肝癌細胞后，p-AKT和p-mTOR的表達水平均降低。

綜上所述，二甲雙胍能抑制肝癌細胞增殖，誘導細胞凋亡，下調Bcl-2/Bax，其機制可能與抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路激活有關。