蝦青素對腦出血大鼠的神經保護作用及機制

周子薇，鄭曉梅，先耀，涂婷，左清嬌

西南醫科大學附屬醫院，四川瀘州646000

腦出血是指非外傷性腦實質內出血，具有較高的致殘率和病死率?，F治療腦出血的有效藥物較少，減輕腦出血繼發性的腦損傷是當前研究的熱點和難點。腦出血后血腫壓迫、腦組織水腫被認為是影響患者恢復的重要原因，而血腦屏障被破壞是導致腦水腫的重要原因[1]。蝦青素是海洋生物體內主要的類胡蘿卜素，易通過血腦屏障，具有強抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗凋亡、免疫調節等多種生物學活性[2]。因其具備多種生物學活性，又可以通過血腦屏障，因此對帕金森病、阿爾茲海默病等神經系統疾病具有治療作用。研究發現，蝦青素能明顯改善腦創傷、腦梗死、脊髓損傷、帕金森病等疾病的神經功能，發揮神經保護作用[3]。目前,關于蝦青素對腦出血神經保護作用的報道較少。2018年12月～2019年12月，我們通過構建腦出血大鼠模型，觀察蝦青素對腦出血大鼠的神經保護作用，并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級健康雄性SD大鼠168只，8周齡，體質量180～220 g，購于成都達碩實驗動物有限公司。大鼠分籠飼養，自由進食及飲水。飼養室保持清潔通風，相對濕度、溫度恒定，全天12 h時間光照。適應性喂養1周后用于實驗。

1.1.2 主要試劑與儀器 蝦青素購于Macklin公司，分別取4、8 mg蝦青素加入2 mL金龍魚花生油，配置成2、4 mg/mL的混懸液。伊文思藍(EB)染料購自上?？道噬锟萍加邢薰?，血清炎癥因子TNF-α、IL-1β ELISA檢測試劑盒購于ELK Biotechnology公司；人Rho關聯含卷曲螺旋蛋白激酶2(ROCK2)兔抗大鼠抗體購于CST公司，緊密連接蛋白5(Claudin5)兔抗大鼠抗體購于Bioss公司。普通光學顯微鏡為日本OLYMPUS產品。

1.2 動物分組與造模 將168只大鼠按照隨機數字表法分為模型對照組、低劑量蝦青素組、高劑量蝦青素組各42只。術前禁食8 h，6%水合氯醛腹腔麻醉，固定于腦立體定位儀上。暴露顱骨前囟及冠狀縫，定位右側尾狀核(以前囟為中心，向后0.2 mm，右側旁開3 mm，深6 mm)，鉆孔。模型組從鼠尾靜脈取血50 μL，采用“改良二次注血法”注血；假手術組注射等量生理鹽水。注射完成后，緩慢拔針并縫合切口[4]。造模2 h后對模型組進行Longa評分[5]，1～3分為造模成功。

1.3 干預方法 低劑量蝦青素組、高劑量蝦青素組分別給予蝦青素20、40 mg/(kg·d)灌胃[6]，假手術組、模型對照組分別給予等體積花生油灌胃，連續7 d。

1.4 神經功能評價 分別于藥物干預1、3、7 d，采用Garcia法進行神經功能評分，最高分18分，評分越低表示神經功能障礙越嚴重[5]。

1.5 血清TNF-α、IL-1β水平檢測 于藥物干預1、3、7 d，每組分別隨機取6只大鼠，采集尾靜脈血1 mL，離心取上清液，采用ELISA法測定血清TNF-α、IL-1β水平，按照試劑盒說明書步驟操作。

1.6 腦組織含水量測定 于藥物干預1、3、7 d，每組分別隨機取4只大鼠，常規稱重、麻醉，斷頭取腦組織，稱取濕重;100 ℃烘烤箱內烘烤24 h，稱取干重。腦組織含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.7 血腦屏障通透性觀察 采用EB染色。于藥物干預1、3、7 d，每組分別隨機取4只大鼠，經尾靜脈注射2% EB，3 h后常規稱重、麻醉。暴露心臟，固定灌注針，右心耳處剪小口形成灌注液排出通道，生理鹽水灌注至清亮液體流出。取腦組織，稱取濕重。制備腦組織勻漿，加3 mL甲酰胺溶液，60 ℃恒溫箱孵育48 h，1 600 r/min離心25 min，取上清液，分光光度計于波長632 nm處測定吸光度值。繪制標準曲線計算EB濃度，根據公式計算EB含量，以此表示血腦屏障通透性。EB含量(μg/g腦濕重)=EB濃度(μg/mL)×甲酰胺容積(mL)/濕重(g)。

1.8 腦組織ROCK2、Claudin5蛋白表達檢測 采用免疫組化SP法。將上述取尾靜脈血后的大鼠常規稱重、麻醉，暴露心臟，固定灌注針，按1.6方法灌注生理鹽水。待清亮液體流出后，換成4%多聚甲醛灌注，直至大鼠上半身僵硬。迅速斷頭取腦組織，常規甲醛固定，石蠟包埋，切片、脫水、PBS反復漂洗；EDTA微波修復、PBS漂洗、避光孵育、漂洗；加封閉液、去除封閉液加一抗ROCK2、Claudin5，4 ℃過夜，PBS漂洗后加二抗孵育50 min，PBS漂洗；加DAB溶液在顯微鏡控制顯色，沖洗；蘇木素復染，氨水返藍，沖洗，梯度乙醇脫水、透明、封固，普通光學顯微鏡(400×)下觀察腦組織染色情況。應用Image-Pro Plus6.0軟件選取相同的棕黃色作為陽性標準，分析每張照片陽性的累積光密度值(IOD)。

2 結果

2.1 四組干預不同時間神經功能評分比較 見表1。

表1 四組干預不同時間神經功能評分比較(分，

2.2 四組干預不同時間血清TNF-α、IL-1β水平比較 見表2。

表2 四組干預不同時間血清TNF-α、IL-1β水平比較

2.3 四組干預不同時間腦組織含水量及血腦屏障通透性比較 見表3。

表3 四組干預不同時間腦組織含水量及EB含量比較

2.4 四組干預不同時間腦組織ROCK2、Claudin5蛋白表達比較 見表4。

表4 四組干預不同時間腦組織ROCK-2、Claudin5蛋白表達比較

3 討論

蝦青素屬于萜烯類不飽和化合物，分子式為C40H52O4，具有很長的共軛烯烴雙鍵，其兩個終端均含酮基和羥基，極性端可猝滅單線態氧，非極性中間段又能清除氧自由基，故其具備超強的抗氧化能力[6，7]。此外，蝦青素還能夠抑制ROS，調控Nrf2通路[8]；參與線粒體調控的凋亡通路，抑制caspase3表達；調控炎癥反應等[3，9]。研究顯示，蝦青素可以通過超強的抗氧化能力改善蛛網膜下腔出血小鼠的血腦屏障通透性，保護血腦屏障[10]。腦出血后，氧化應激、炎癥反應及基質金屬蛋白酶等因素都會使血腦屏障破壞，滲透性改變，造成腦組織內環境紊亂，加劇腦出血后繼發性腦損傷。本研究結果顯示，大鼠腦出血后1、3、7 d神經功能均有不同程度的受損，其中3 d時的神經缺損癥狀最嚴重；經蝦青素治療后，神經功能得到明顯改善，以高劑量組效應更明顯。同時大鼠腦出血后各時間點的腦組織含水量、EB含量明顯升高，而蝦青素治療組的腦組織含水量及EB含量均低于模型對照組，并能明顯改善3 d腦水腫高峰期的腦水腫程度，降低腦疝形成風險，從而改善大鼠的神經缺損癥狀，具有一定的神經保護作用。

血腦屏障是由小膠質細胞、星形膠質細胞、內皮細胞、緊密連接等構成的一道血液與腦組織、腦脊液之間的屏障，具有選擇性轉運、維持腦組織內環境穩定的重要作用，也對腦水腫的形成和發生起著關鍵作用[11]。ROCK2和Claudin5蛋白是調節血腦屏障通透性的重要因子。ROCK2即Rho相關卷曲螺旋形成蛋白激酶2，主要在大腦、脊髓表達，其底物有肌球蛋白輕鏈磷酸酶、肌球蛋白等，具有調節血管內皮細胞收縮、黏附、遷移、凋亡等作用[12]。同時被認為是調節血腦屏障通透性的有效靶點，其與LPS誘導的緊密連接蛋白水平降低有關[13]。腦出血后血腫所釋放的凝血酶、血紅蛋白及分解代謝產物可能會激活ROCK2蛋白，使其表達水平增加，活化后的ROCK2可增加基質金屬蛋白酶9(MMP-9)的表達，降解細胞外基質的層粘連蛋白及內皮細胞間的緊密連接，造成血腦屏障結構和功能破壞，加重腦水腫[14]。緊密連接是血腦屏障的重要組成部分，包括跨膜蛋白(Claudins、occludin、連接黏附分子)、胞質附著蛋白、細胞骨架蛋白等[15]，具有主動調節功能，緊密連接的改變可造成血腦屏障結構和功能異常。Ohtsuki等[16]發現，外源性表達的Claudin5可誘導血腦屏障生成，Claudins還可參與氧化應激、胞內鈣離子吸收等病理生理過程，在缺血性腦損傷時，Claudin5被MMP降解，血腦屏障滲透性升高，同時它也是重要的滲透性調節因子，其下降程度可反映血腦屏障通透性的破壞情況[17]。

本研究結果顯示，腦出血大鼠成模1 d時模型對照組、蝦青素治療組腦組織中ROCK2蛋白表達水平開始升高，Claudin5蛋白表達減少，3 d時效應最明顯。這與血腦屏障通透性增加、腦組織含水量升高結果一致，說明腦出血后ROCK2蛋白激活導致Claudin5蛋白被分解，破壞了血腦屏障緊密連接，加劇腦組織水腫；而與模型對照組相比，蝦青素治療組各時間點腦組織中ROCK2蛋白表達減少，Claudin5表達升高，腦水腫程度減輕，血腦屏障通透性得到改善。這提示蝦青素可能通過抑制ROCK2過度表達起到保護腦組織的作用，且高劑量組優于低劑量組。另一方面，腦出血后大鼠血清炎癥因子IL-1β、TNF-α水平升高，這可能與活化的ROCK2促進NF-κB向核內轉移，加劇炎癥反應、免疫反應有關;蝦青素治療組不同時間點IL-1β、TNF-α水平較模型對照組均下降，提示蝦青素可抑制腦出血后的炎癥反應，從而減輕細胞毒性腦損害，發揮神經保護作用。

綜上所述，蝦青素能夠抑制腦出血后的炎癥反應，減輕細胞毒性腦損害；同時改善血腦屏障通透性和減輕腦水腫，改善腦出血大鼠早期腦損傷的神經功能；其機制可能是通過抑制ROCK2蛋白表達、保護Claudin5蛋白來發揮作用。