燈盞乙素對β淀粉樣蛋白誘導的神經母細胞瘤細胞谷氨酸/γ氨基丁酸通路的影響

李曉宇，于燕妮，郭莉莉

1貴州醫(yī)科大學，貴陽550001；2貴陽市第一人民醫(yī)院

阿爾茨海默病(AD)是一種慢性進行性神經退行性疾病，涉及記憶障礙和行為障礙。β淀粉樣蛋白(Aβ)級聯(lián)假說是AD發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)，Aβ可導致細胞外谷氨酸(Glu)水平升高，從而產生Glu興奮性神經毒性損傷神經細胞。而細胞外Glu濃度及作用主要與Glu/γ氨基丁酸(GABA)對神經系統(tǒng)的平衡調節(jié)作用有關[1，2]。Glu轉運體與GABA轉運體協(xié)同作用，共同維持突觸間隙的Glu和GABA含量，參與正常神經元活動及大腦的多種病理過程；轉運功能一旦受損或協(xié)同失衡，將導致突觸間隙內的Glu濃度升高，持續(xù)激活Glu受體，繼之造成突觸后神經元持續(xù)興奮，介導細胞Ca2+超載，產生大量自由基，形成氧化應激，致神經元損傷，產生神經毒性[3]。EAAT3是Glu通路的重要轉運蛋白，N-甲基-D-天門冬氨酸受體亞型1(NMDAR1)是Glu通路的重要受體，而γ氨基丁酸轉運體1(GAT-1)是GABA通路的重要轉運蛋白，三者共同參與介導Glu興奮性神經毒性過程。燈盞乙素(Scu)是燈盞細辛的藥理活性成分，其通過抗氧化、清除ROS、抗炎、抑制細胞凋亡等途徑發(fā)揮神經保護作用[4]。2019年2～10月，我們將Aβ1-42作用于人源性神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞，誘導AD神經元損傷細胞模型，觀察Scu對細胞中Glu/GABA平衡系統(tǒng)協(xié)同作用的相關遞質、蛋白以及氧化應激指標的影響，探討Scu抑制Glu興奮性神經毒性損傷的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞與藥物 人源性神經母細胞瘤(SH-SY5Y)細胞株，購自中國科學院昆明細胞生物研究所。實驗用Scu(南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，純度98%，批號：ZL20161012037)，精確稱量分裝后置4 ℃保存，使用前加入DMEM充分稀釋，并用0.22 μm微孔注射濾器過濾。Aβ1-42寡聚體粉末(強耀生物科技有限公司，純度95.27%，貨號：04010011526)，用預冷的六氟異丙醇(HFIP)配制成1 mmol/L的溶液，風干，-80 ℃保存，使用前加不含酚紅的F12培養(yǎng)基充分溶解，4 ℃放置24 h后離心取上清。

1.1.2 試劑與儀器 Glu、GABA、總超氧化物歧化酶(T-SOD)、丙二醛(MDA)檢測試劑盒(南京建成公司)；EAAT3、GAT-1、NMDAR1抗體(博士德公司)；多功能酶標儀(美國Thermo Fisher公司)；臺式高速冷凍離心機(Eppendorf Germany公司)；BIO-RAD電泳設備(美國Bio-Rad公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 取SH-SY5Y細胞，加入完全培養(yǎng)液(90%高糖DMEM，10%胎牛血清，1%青/鏈霉素)，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d換液1次，3～4 d傳代。實驗重復3次。

1.2.2 細胞分組與處理 取對數(shù)生長期細胞，分為對照組、Aβ組、Scu組、Scu+Aβ組。對照組常規(guī)培養(yǎng)，不加任何藥物；Scu組加入10 μmol/L Scu作用48 h；Aβ組加入1 μmol/L Aβ作用24 h；Scu+Aβ組先加入10 μmol/L Scu預處理24 h，再加入1 μmol/L Aβ作用24 h。

1.2.3 細胞外液Glu含量檢測 采用生物化學法。收集0.2 mL細胞培養(yǎng)液，加入0.6 mL試劑一充分混勻，3 000 r/min離心10 min，取上清。設定空白管、標準管、測定管，分別加入0.5 mL蒸餾水、Glu標準應用液、待測上清，然后每管依次加入試劑二、試劑三、試劑四，混勻，上酶標儀于340 nm處測吸光度A1。各管再加入試劑五，混勻，37 ℃水浴40 min，于340 nm處測吸光度A2，計算Glu濃度。Glu濃度=[(測定A2-測定A1)-(空白A2-空白A1)]/[(標準A2-標準A1)-(空白A2-空白A1)]×標準品濃度×樣本稀釋倍數(shù)。

1.2.4 細胞外液GABA含量檢測 采用ELISA法。收集各組細胞培養(yǎng)液，3 000 r/min離心10 min，取上清。取96孔板，設置空白孔、標準孔、待測樣本孔，加入樣本和標準品；加入生物素抗原，37 ℃孵育30 min，洗板5次；加親和素HRP，37 ℃孵育30 min，洗板5次；加顯色液A、B，37 ℃顯色10 min；加終止液。上酶標儀于450 nm處測A值。根據標準品濃度及A值繪制標準曲線，根據標準曲線回歸方程計算GABA含量。

1.2.5 EAAT3、GAT-1、NMDAR1蛋白表達檢測 采用Western blotting法。收集各組細胞，加入蛋白裂解液提取總蛋白，進行蛋白定量。采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜，分別加入相應的蛋白一抗(β-actin稀釋比例1∶200；EAAT3稀釋比例1∶200；GAT-1稀釋比例1∶200；NMDAR1稀釋比例1∶500)和二抗(二抗稀釋比例1∶50 000)，孵育后曝光顯影，定影。用Bandscan分析灰度值，以目標條帶與β-actin條帶的灰度比值表示目標蛋白的相對表達量。

1.2.6 細胞T-SOD活力檢測 采用黃嘌呤氧化酶法。收集各組細胞，用反復凍融的方法破碎細胞，離心，取上清，用BCA法檢測上清液中的蛋白濃度，取96孔板，設定對照孔(蒸餾水)和測定孔(細胞上清)，依次加入工作液后混勻，37 ℃水浴40 min。加入顯色劑混勻后室溫放置10 min，于波長550 nm處測A值，根據公式計算T-SOD活力。總SOD活力=(對照孔A值-測定孔A值)/對照孔A值/0.5×(反應液總體積/取樣量)/蛋白濃度。

1.2.7 細胞MDA含量檢測 采用TBA法。收集各組細胞，用反復凍融的方法破碎細胞，離心，取上清，用BCA法檢測上清液中的蛋白濃度。取5 mL試管，設置空白管、標準管、測定管、對照管。依次加入工作液后混勻，95 ℃水浴40 min，取出后流水冷卻，4 000 r/min離心10 min。取上清，于532 nm處測A值，并計算MDA濃度。MDA濃度=[(測定管A值-對照管A值)/(標準管A值-空白管A值)]×標準品濃度/待測樣本蛋白濃度。

2 結果

2.1 各組細胞外液Glu、GABA含量比較 與對照組比較，Scu組細胞外液Glu、GABA無明顯變化(P均>0.05)，Aβ組細胞外液Glu升高、GABA降低(P均<0.05)；與Aβ組比較，Scu+Aβ組細胞外液Glu降低、GABA升高(P均<0.05)。見表1。

表1 各組細胞外液Glu、GABA含量比較

2.2 各組細胞EAAT3、GAT-1、NMDAR1蛋白表達比較 與對照組比較，Aβ組細胞EAAT3、GAT-1和NMDAR1蛋白表達升高(P均<0.05)；與Aβ組比較，Scu+Aβ組細胞EAAT3、GAT-1和NMDAR1蛋白表達降低(P均<0.05)。見表2。

表2 各組細胞GAT-1、EAAT3、NMDAR1蛋白相對表達量比較

2.3 各組細胞T-SOD活力、MDA含量比較 與對照組比較，Aβ組細胞T-SOD活力降低、MDA含量升高(P均<0.05)；與Aβ組比較，Scu+Aβ組細胞T-SOD活力升高、MDA含量降低(P均<0.05)。見表3。

表3 各組細胞T-SOD活力、MDA含量比較

3 討論

Scu是從中草藥燈盞花中提取的黃酮類有效成分，既往多用于心腦血管疾病的治療。近年研究發(fā)現(xiàn)，Scu還有保護神經細胞的作用。我們的前期研究顯示，Scu能夠介導K+-ATP通道開放、調控IP3R-Ca2+通道，通過調控組蛋白H2A、H2B、H3表達來抑制Aβ的神經毒性[5～7]。本研究進一步觀察Scu對Aβ誘導的神經母細胞瘤細胞Glu/GABA通路的影響。

Glu是大腦最主要的興奮性神經遞質。Glu作用于突觸后膜的離子型谷氨酸受體產生生理作用，參與神經元通信、突觸可塑性、神經元生長、分化以及學習和記憶等生理過程[8]。NMDAR屬于離子型谷氨酸受體的亞型之一，NMDAR1是NMDAR的功能性亞單位，是Glu通路的重要受體。當Glu完成生理活動后，突觸間隙并沒有相應的酶水解Glu失活，必須由興奮性氨基酸轉運體(EAAT)轉運清除，維持突觸間隙Glu的低水平。EAAT3是EAAT的亞型之一，主要表達于神經元細胞，參與維持大腦局部神經細胞外的Glu濃度[9]。

GABA是大腦重要的抑制性神經遞質。當GABA神經元興奮時，釋放GABA作用于Glu神經元的GABA受體，抑制神經元釋放Glu，此過程叫突觸前抑制；GABA也可以作用于突觸后膜的GABA受體，引起Cl-內流，抑制突觸后神經元興奮，此過程叫突觸后抑制。GABA在突觸間隙的濃度需要GABA轉運體(GAT)來維持。GAT-1是GAT表達最豐富、最重要的亞型，可促進GABA回吸收到突觸前神經元中，從而控制突觸間隙GABA含量[10]。

GAT-1和EAAT3都是間接耗能的轉運蛋白，當供能不足時二者功能發(fā)生異常，并且順濃度梯度釋放GABA和Glu[11]。Glu遞質通路和GABA遞質通路相互拮抗，共同維持神經細胞的興奮/抑制的平衡。當GABA的抑制作用減弱，或細胞釋放Glu過多，或Glu異常轉運等情況下細胞外液Glu增加，過度激活離子型Glu受體，由于NMDAR的親鈣性，會引發(fā)細胞外Ca2+內流增加，導致細胞內鈣超載，激活大量鈣離子依賴性酶，如蛋白激酶C、磷酸脂酶A、一氧化氮合酶等，使蛋白質水解、細胞骨架和細胞膜受損等，同時產生大量自由基，氧化與抗氧化失衡，氧化應激形成，致神經元損傷，該過程稱為Glu的興奮性毒性的級聯(lián)反應[8]。

本研究結果顯示，Aβ寡聚體作用于SH-SY5Y細胞后，細胞外液Glu增加、GABA降低。突觸間隙Glu、GABA含量主要取決于神經細胞對Glu、GABA的釋放和攝取清除功能，提示Aβ寡聚體可能影響Glu、GABA的釋放和攝取功能介導細胞外液Glu的增加。體內外研究均顯示，Aβ寡聚體能與神經細胞作用促使細胞釋放Glu增加[12]，Glu作用于突觸后膜增加的NMDAR，NMDAR激活后主要介導Ca2+內流，細胞內Ca2+增加。線粒體作為細胞Ca2+穩(wěn)態(tài)的重要調節(jié)器，線粒體不僅通過鈣單向轉運蛋白吸收大量的Ca2+，而且促進ATP依賴性鈣的擠出以調節(jié)維持細胞內Ca2+的生理濃度[13]。輕度的Glu興奮性神經毒性介導的細胞內Ca2+增加會導致短暫的線粒體去極化，可逆的ATP合成減少，而持續(xù)的興奮性毒性或者嚴重的Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡會導致不可逆的線粒體去極化、永久性能量崩塌和離子失衡[14]。如果Aβ毒性不解除，線粒體對Aβ誘發(fā)的Glu毒性介導的Ca2+穩(wěn)態(tài)失調難以糾正，并且線粒體Ca2+升高，抑制ATP合成[7，13]。提示Aβ毒性可能介導Glu興奮毒性,并且導致線粒體功能異常。

突觸遞質的傳遞過程是高耗能過程，所以盡管本研究觀察到EAAT3表達增加，但結果提示細胞外液Glu并沒有減少反而增加，提示轉運Glu功能異常，可能順Glu濃度梯度釋放細胞內的Glu，更加重了細胞外液Glu的高濃度，而GABA并沒有升高，并不是表達增加的GAT-1轉運了GABA，因為GAT-1的正常轉運功能同樣是高耗能過程。研究表明，GABA的合成原料是GABA神經元上的EAAT3轉運入細胞的Glu，在谷氨酸脫羧酶催化下參與合成GABA[2]，然而EAAT3異常轉運Glu，導致GABA神經元利用Glu合成GABA減少，GABA釋放減少，提示GABA減少可能與GABA合成異常有關。GABA的抑制作用減弱，加劇興奮/抑制信號失衡并進一步促進興奮性毒性，Glu持續(xù)作用并強直激活NMDAR介導細胞內Ca2+超載，線粒體基質內大量Ca2+負載，引起不可逆轉的線粒體功能障礙，呼吸鏈異常，氧自由基增加，打破氧化與抗氧化平衡，介導氧化應激，攻擊細胞膜結構和核酸[15]。

SOD是生物體內的一種重要的抗氧化劑。MDA是脂質過氧化產物之一，其含量可反映生物膜過氧化的程度，也間接反映導致生物膜脂質過氧化的氧自由基的含量。抗氧化劑SOD減少與自由基增加提示細胞存在氧化應激和線粒體損傷。我們的前期實驗顯示，Scu能抑制線粒體通透性轉換孔(MPTP)的開放，穩(wěn)定線粒體功能，增加ATP生成，減少氧自由基和凋亡啟動因子釋放，進而減少氧化應激損傷和凋亡發(fā)生[7，13]。本研究結果顯示，與對照組比較，Aβ組T-SOD活力降低、MDA含量升高，表明Aβ誘導神經母細胞瘤發(fā)生氧化損傷；與Aβ組比較，Scu+Aβ組T-SOD活力升高、MDA含量降低，表明Scu具有抗氧化作用。

研究顯示，Scu可通過抗氧化改善線粒體功能，增加ATP生成，從而改善EAAT3、GAT-1的轉運功能。EAAT3轉運清除細胞外增加的Glu，并促進GABA合成釋放，細胞外低濃度的GABA不能觸發(fā)GAT-1轉運功能，因為此時Glu毒性沒有完全糾正，突觸間隙需要GABA介導抑制信號抑制神經細胞釋放Glu。本研究結果顯示，Scu+Aβ組細胞外液Glu含量減少，GABA含量增加，提示Scu重新調節(jié)了細胞外Glu、GABA平衡，降低了Glu的興奮性神經毒性。經Scu干預后，Aβ介導的EAAT3、GAT-1、NMDAR1蛋白表達降低。盡管Scu+Aβ組上述指標未達到正常對照組的水平，但較Aβ組有明顯改善，并且Scu組與正常對照組所有指標均無統(tǒng)計學差異，說明Scu對正常細胞沒有影響，Scu的調節(jié)作用可能發(fā)生在Aβ誘導Glu/GABA通路改變之后。

綜上所述，Scu可能通過抗氧化作用改善線粒體功能障礙，間接改善EAAT3和GAT-1的轉運障礙，同時下調谷氨酸受體亞型NMDAR1的表達，減少Glu的作用受體，從而減輕Aβ介導的谷氨酸興奮性神經毒性損傷。