抑制激肽釋放酶9對肝癌細胞MHCC97H增殖、遷移和侵襲的影響研究＊

朱小華 ，鄒霞 ，殷俊翔 ，黃長文 ，李洪生 ，饒雪峰

（1.江西省人民醫院，南昌 330006；2.江西省婺源縣人民醫院，婺源 333200）

原發性肝細胞癌 ( hepatocellular carcinoma，HCC，簡稱肝癌) 是我國常見的惡性腫瘤之一。 我國HCC 占全球發病的40%以上，且近年來發病率有增高趨勢。激肽釋放酶9(KLK9)是激肽釋放酶基因家族的一個新成員，在人類染色體19q13.4 位置上，KLK9 基因由 5 個編碼蛋白的外顯子， 以及4個將其分隔的內含子組成。 編碼 KLK9 蛋白的基因區域是由753bp 個堿基形成， 編碼了一個預計分子量為27.5kDa 的多肽；研究發現KLK9 基因高表達與腫瘤的發生發展相關。 本課題組前期研究[1]發現KLK9 在肝癌組織中過表達，并與肝癌的發生發展具有相關性；本實驗利用siRNA 干擾技術，進一步觀察抑制KLK9 基因對肝癌細胞MHCC97H增殖、侵襲轉移的影響。

1 材料與方法

1.1 引物設計在 GeneBank 基因庫中查 KLK9,GAPDH 的基因序列，并用Oligo7 軟件來設計分析KLK9(RT-PCR),GAPDH 的引物，并由上海吉凱基因技術公司合成。 正鏈引物5’-CGCCAATGACC ACAATGATGA3’，負鏈引物：5’-CCAGCCTGAGAT GAGACACT3’， 擴 增 產 物 長 度 為 133bp； 內 參GAPDH 上游引物為 5’-CCCACTCCTCCACCTTTG AC3’，下游引物為 5’-TCTTCCTCTTGTGCTCTTGC-3’，產物大小為 182bp。

1.2 細胞的培養人肝癌細胞株 MHCC97H 購自上海細胞庫， 細胞用含有10%滅活胎牛血清的RMPI-DMEM 培養基培養， 細胞置于 37 ℃，5%CO2孵箱中進行培養； 待細胞融合率達到70%-80%時，用胰酶消化細胞，終止消化，離心之后鋪板；6 孔板中，每孔 5×106，待細胞融合率達到 90%，加入1ml trizol 裂解細胞。

1.3 轉染KLK9-siRNA 購自 Dharmacon (Lafayette,CO, USA)，轉染前 1d，將 1.0×105個對數期生長的細胞接種于24 孔培養板，1ml／孔，培養過夜；次日按照Lipofectamine@RNAi MAX 轉染試劑操作說明,瞬時轉染至肝癌細胞。 轉染分組如下：空白對照、雜序對照組和siRNA-KLK9 轉染組。

1.4 實時定量反轉錄聚合酶鏈反應（RT-qPCR）檢測各組細胞目的基因的mRNA 表達水平。轉染48h后收集實驗所有細胞，Trizol 法提取總RNA， 逆轉錄合成cDNA 后， 以其為模板， 進行PCR 擴增反應。反應條件：預變性95℃ 5min，變性95℃ 30s，退火 59℃ 15s，延伸 72℃ 30s，循環 35 次。 反應總體系 20μl,2x real-time PCR mix 10μl，上下游引物各1μl，cDNA 1μl,去離子水 7μl；在 PE5700 實時熒光定量PCR 儀器上進行實時定量擴增。 實驗中每個樣品重復3 次，KLK9mRNA 的表達量采用相對定量法計算，其相對表達量=2-△△Ct，其中△Ct=目的基因 mRNA 的 Ct 值-內參 Ct 值。

1.5 Western blot 分別提取各組細胞的總蛋白并用 BCA 法定量，SDS-PAGE 電泳分離， 轉 PVDF膜，置于5%脫脂奶粉封閉1h，分別孵育于KLK9，p-ERK，VEGF 和 GAPDH 等兔單抗 （Santa Cruz Biotechnology 公司）（1:4000）中，4 ℃的冰箱中孵育過夜；TBST 洗膜后加入二抗 （羊抗兔）（Santa Cruz Biotechnology 公司）（1:5000），在室溫下，置于搖床上緩慢搖動孵育l h，TBST 洗膜后用ECL 法顯影，然后通過Quenity one 軟件進行結果分析； 以上實驗重復3 次。

1.6 CCK-8 檢測細胞增殖實驗 收集各組細胞用0.25%的胰蛋白酶消化成單細胞懸液，調整濃度為3×104/ml，以每孔 100μl 接種于 96 孔板中，置于培養箱中培養。分別于 24、48、72 和 96h 進行 CCK-8法檢測，加入 CCK-8 液體 10μl，繼續培養 2h 后，酶標儀490nm 波長檢測光密度值（OD）。

1.7 細胞劃痕 ⑴鋪板： 在六孔板背面畫3 條直線，待細胞融合率到達80%左右，并且細胞狀態良好，消化細胞，收集離心棄上清，用1ml DMEM 培養基重懸細胞，計數，向6 孔板中接種細胞，每孔1×105個細胞。 ⑵劃痕：垂直于事先畫好的直線，用中槍頭在孔板里細胞上劃痕。 棄掉培養基，用PBS吸掉漂浮的細胞。 加入血清培養基 (10% FBS DMEM)；這時候立即用顯微鏡拍照，即為0 h。 然后持續觀察與記錄細胞遷移情況。

1.8 Transwell 細胞侵襲實驗細胞轉染72h 后消化細胞并重懸于無血清的RPMI-1640 培養基中制成細胞懸液。 將各組細胞分別按1×104個/孔加入Transwell 小室中的上室， 下室加入500UL 含10%FBS 的培養基，繼續培養48h，培養結束后用棉簽輕擦去上室膜上表面的細胞， 位于下表面的侵襲細胞用4%多聚甲醛固定，1%結晶紫染色， 風干；200 倍的倒置顯微鏡下拍照，任意取6 個視野計算細胞數。

1.9 統計學處理 應用GraphPad Prism version 5.01 軟件進行 One-way ANOVA （Tukey's Multiple Comparison Test） 檢驗，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 siRNA 干擾 KLK9 基因對 KLK9mRNA 和蛋白的表達水平影響 結果，siRNA 干擾KLK9 基因后，KLK9mRNA 和蛋白表達水平在肝癌細胞MHCC97H 中明顯降低，P<0.0001（見圖1 和表1）。(GAPDH:37KDa, KLK9:27.5KDa)

2.2 Western blot 檢測 siRNA 干擾 KLK9 基因對肝癌細胞p-ERK 和VEGF 蛋白的表達水平影響 結果 顯 示 ，siRNA 干 擾 KLK9 基 因 后 ，p-ERK 和VEGF 蛋白表達水平在 MHCC97H 細胞中明顯降低 （見圖2，3 和表2）。 (p-ERK:42/44KDa,VEGF:42KDa)

圖1 siRNA 干擾后KLK9 蛋白的表達水平

表1 siRNA 干擾后 KLK9mRNA 和 KLK9 蛋白的表達水平（±s）

表1 siRNA 干擾后 KLK9mRNA 和 KLK9 蛋白的表達水平（±s）

分組 KLK9 mRNA（2-△△Ct） KLK9 蛋白水平（KLK9/GAPDH）空白對照組雜序對照組實驗組1 F P 0.980±0.017 0.300±0.150 47.14 0.0002 0.887±0.097 0.865±0.081 0.126±0.020 112.1<0.0001

圖2 siRNA 干擾后MHCC97H 細胞中p-ERK 蛋白水平

圖3 siRNA 干擾后MHCC97H 細胞中VEGF 蛋白水平

表2 siRNA 干擾后 MHCC97H 細胞中 p-ERK 和 VEGF 蛋白水平（±s）

表2 siRNA 干擾后 MHCC97H 細胞中 p-ERK 和 VEGF 蛋白水平（±s）

分組 p-ERK 蛋白水平 VEGF 蛋白水平空白對照組雜序對照組實驗組F P 1.460±0.100 1.357±0.090 0.715±0.071 54.74 0.0001 0.829±0.046 0.816±0.069 0.578±0.047 20.46 0.002

2.3 CCK-8 檢測法檢測siRNA 干擾KLK9 基因對肝癌細胞增殖的影響 結果顯示，siRNA 干擾KLK9 基因 96h 后，MHCC97H 肝癌細胞增殖能力明顯減弱，P<0.0001（見圖4 和表3）。

圖4 siRNA 干擾后MHCC97H 肝癌細胞增殖情況：通過CCK-8檢測發現siRNA 轉染96 小時后，MHCC97H 肝癌細胞增殖能力較空白對照組和雜序對照組顯著減弱，P＜0.0001

2.4 劃痕實驗檢測siRNA 干擾KLK9 基因對肝癌細胞遷移能力的影響 結果顯示，siRNA 干擾KLK9 基因后，MHCC97H 肝癌細胞遷移能力明顯減弱，P<0.05（見表4 和圖5）。

表3 siRNA 干擾后 MHCC97H 肝癌細胞增殖的影響（n=3，±s）

表3 siRNA 干擾后 MHCC97H 肝癌細胞增殖的影響（n=3，±s）

實驗分組 OD 值（96h） F P空白對照組雜序對照組實驗組1.691±0.042 1.751±0.532 1.282±0.039 84.76 <0.0001

圖5 siRNA 干擾后MHCC97H 肝癌細胞遷移情況：通過劃痕實驗發現siRNA 轉染66 小時后，MHCC97H 肝癌細胞遷移能力較對照組顯著減弱，P＜0.01

表4 siRNA 干擾后 MHCC97H 肝癌細胞遷移能力（n=3，±s）

表4 siRNA 干擾后 MHCC97H 肝癌細胞遷移能力（n=3，±s）

分組 遷移率(%) F P空白對照組雜序對照組實驗組56.83±5.73 53.81±12.07 27.24±8.43 8.647 0.017

2.5 Transwell 檢測 siRNA 干擾 KLK9 基因對肝癌細胞侵襲能力的影響 結果顯示，siRNA 干擾KLK9 基因后， MHCC97H 肝癌細胞侵襲能力明顯減弱，P<0.05（見表5 和圖6）。

圖6 siRNA 干擾后 MHCC97H 肝癌細胞侵襲情況：通過Transwell 實驗發現siRNA 轉染后，MHCC97H 肝癌細胞侵襲能力較對照組顯著減弱，P＜0.01

表5 siRNA 干擾后 MHCC97H 肝癌細胞侵襲能力（n=3，±s）

表5 siRNA 干擾后 MHCC97H 肝癌細胞侵襲能力（n=3，±s）

分組 侵襲數(個) F P空白對照組雜序對照組實驗組103.46±11.41 97.24±8.76 62.51±4.49 12.29 0.007

3 討論

KLK9 基因在惡性腫瘤的發生發展中起重要作用，研究發現KLK9 高表達與某些類型的腫瘤密切相關。 Shinoda 等[2]通過 RT-PCR 技術檢測發現KLK9mRNA 在膀胱癌細胞株和組織中較正常膀胱細胞株和組織中表達升高。 包香香等[3]發現 KLK9在惡性卵巢腫瘤中的陽性表達率高于良性及交界性腫瘤。 Memari 等[4]亦認為KLK9 可能作為乳腺癌和卵巢癌重要標志物。 而Geng X 等[5]通過 PCR 檢測發現KLK9 在大多數晚期高等級漿液性卵巢癌組織樣本中 mRNA 表達水平均較低， 且KLK9mRNA 表達水平與患者預后無明顯關聯性。Yousef 等[6]發現KLK9 在早期乳腺癌患者和小腫瘤患者中的表達會明顯升高，KLK9 陽性患者無病生存時間更長，總生存時間更長。 而 Drucker KL 等[7]發現 KLK9 與高分化膠質瘤有關， 并與不良預后有關。本課題組前期研究發現[1]：KLK9 蛋白質在肝癌組織中的表達明顯高于肝癌癌旁組織和正常肝組織中的表達；KLK9mRNA 在肝癌細胞株中的表達水平較正常肝細胞表達明顯升高； 提示 KLK9基因與肝癌發生密切相關， 在肝癌的發生中起重要作用。Adamopoulos PG 等[8]對 17 種不同的人類癌組織(包括乳腺癌、卵巢癌、子宮內膜癌、前列腺癌、大腸癌、胃癌、肝細胞癌、肺腺癌等)中的KLK9基因進行選擇性剪接轉錄及分子克隆， 并通過新一代測序技術發現 KLK9 基因可作為診斷和/或預后的新候選生物標志物，并作為治療策略的目標。Shinoda 等[2]發現KLK9mRNA 在浸潤性膀胱癌中的表達高于淺表膀胱癌，KLK9 基因在膀胱癌中的表達與膀胱癌分期有關系,腫瘤分期晚，KLK9 表達水平越高, 并且通過 siRNA 干擾這些激肽釋放酶可以抑制膀胱癌細胞的侵襲力,認為 KLK9 在促進膀胱腫瘤癌細胞浸潤有重要的作用。 我們前期研究還顯示[1]： KLK9 蛋白質的陽性表達率與腫瘤大小、分化程度、肝內或淋巴結轉移及臨床分期均呈正相關性，KLK9 蛋白質在大腫瘤、分化程度差、肝內或淋巴結轉移、 臨床分期晚的腫瘤中其陽性表達率更高。 本研究進一步通過增殖、劃痕和侵襲實驗發現，siRNA 干擾 KLK9 基因后， 肝癌細胞MHCC97H 增殖、遷移和侵襲能力明顯減弱，這說明抑制KLK9 基因，可抑制肝癌細胞MHCC97H 增殖、侵犯和轉移。

絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）是一種細胞內信號通路， 其生理功能包括細胞增殖、 凋亡和侵襲、轉移[9]。 細胞外信號調節激酶（ERK）信號通路是 MAPK /ERK 信號通路的關鍵， 包括 ERK1 和ERK2，它通常位于細胞質中。 P-ERK1/2（磷酸化ERK1/2）是ERK1/2 的激活形式，它將信號從表面受體傳遞到細胞核，調節轉錄因子的活動，產生細胞效應;它的異常表達在細胞的惡性轉化和腫瘤的發展中起著重要的作用[10,11]。 目前 KLKs 家族中成員與ERK 信號通路調節關系研究報道不多，Cao XY 等[12]研究顯示抑制KLK10 基因表達可以通過抑制FAK-SRC-ERK 信號通路的激活， 從而降低胰腺導管腺癌的侵犯和轉移。 本研究發現，siRNA干擾 KLK9 基因后，p-ERK 蛋白表達水平在MHCC97H 細胞中明顯降低，MHCC97H 肝癌細胞增殖、 遷移和侵襲能力明顯減弱， 這提示了抑制KLK9 基因可降低肝癌細胞MHCC97H 增殖、遷移和侵襲的能力與p-ERK 的活性抑制相關。

腫瘤之所以能生長迅速必須依靠新生血管供給營養和排泄代謝產物， 同時通過新生血管轉移腫瘤細胞。 血管內皮生長因子(VEGF)在腫瘤的血管形成中起重要作用[13,14],抑制VEGF 表達，可減少腫瘤新生血管，抑制腫瘤的轉移[15,16]。 本研究亦發現，siRNA 干擾 KLK9 基因后，VEGF 蛋白表達水平在 MHCC97H 細胞株中明顯降低， MHCC97H肝癌細胞遷移和侵襲能力明顯減弱， 這提示抑制KLK9 基因，可能通過抑制VEGF 表達，從而抑制肝癌細胞MHCC97H 遷移和侵襲能力。

總之， 抑制 KLK9 基因可降低肝癌細胞MHCC97H 增殖、 遷移和侵襲能力， 這可能與p-ERK 活性的抑制和VEGF 表達的降低相關； 這些提示了KLK9 基因可能作為肝癌靶向治療的新靶點，為肝癌基因治療提供新的思路和理論基礎。