紫癜性腎炎患兒腎組織和尿液Podocalyxin蛋白表達與足細胞損傷的關系＊

彭曉杰，鄭衛民，傅睿，黃玉輝，鄧美慧，吳小川，陶珊珊

（江西省兒童醫院腎臟科，南昌 330006）

過敏性紫癜( Henoch-Schonlein purpura，HSP)是以全身廣泛性血管炎為主要病理改變的兒童常見病[1]，其導致腎臟受累的發生率國內外報道各不一致，約20 %-80%[2-4]。研究證實，過敏性紫癜患者腎臟是否受累與很多因素有關，如發病年齡、腹痛癥狀、皮疹持續存在、凝血因子Ⅻ活性、是否用皮質激素治療等[5]。 患兒的預后情況與腎臟的臨床表現密切相關, 過敏性紫癜腎炎 ( Henoch-Schonlein purpura nephritis，HSPN) 是導致兒童期慢性腎臟疾病的重要原因之一[6]。

目前腎活檢是判斷腎臟受累與否及受累程度的金標準，但仍存在一定局限性，對FSGS 病理類型可能漏診[7]，且按我國國情大多數患兒及家屬難以接受重復腎活檢。 目前尚無可靠而無創傷性的鑒別診斷方法，這給HSPN 的早期診斷及合理治療帶來障礙。 尿蛋白被公認與腎臟疾病進展相關的獨立因素之一[8]，足細胞能攝取濾過的蛋白，造成細胞結構和功能改變[9]。 研究表明，當足細胞數減少10%-20%時，即開始出現腎小球硬化過程[10]，病理表現為微小病變的腎病綜合征患兒， 足細胞Nephrin、Podocin 和WT1 等蛋白存在分布和表達的異常[11]，而足細胞標志性蛋白Podocalyxin 的研究更備受人們關注。 研究發現[12]，尿足細胞及腎組織Podocalyxin 的表達與腎臟病理、蛋白尿和血尿的程度有關，92.5%腎小球疾病患者尿中可檢測出足細胞蛋白Podocalyxin 的表達， 其敏感性為88.4%，特異性為100%。

臨床上判斷腎小球疾病活動和病變嚴重程度主要以尿蛋白水平，血尿及白細胞尿的出現，尿系列微量蛋白如：尿微量蛋白(MA)、轉鐵蛋白(TRF)、IgG、α1-微球蛋白， 腎功能等作為無創評估指標，此時臨床癥狀往往滯后于病理變化， 故而腎臟病理診斷仍是金標準。 由于腎活檢是一項有創的檢查方法， 而且難以用于動態追蹤觀察， 這無疑給HSPN 的早期診斷及病情追蹤帶來困難，尿足細胞檢測作為一項無創檢查，其特異、快捷、簡便易行、可重復性能彌補腎活檢的缺陷。 目前國內尚無有關HSPN 病理分類、 積分與腎組織足細胞蛋白Podocalyxin 的表達及尿中脫落足細胞Podocalyxin表達關系的報道。 本研究探討足細胞損傷及足細胞蛋白Podocalyxin 的表達變化在HSPN 進展過程中的意義，為HSPN 的早期診治提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取江西省兒童醫院腎臟科2015年 2 月-2017 年 6 月收治的 56 例 HSPN 患兒，均于進行抗血管炎、 激素或免疫抑制劑等治療前行腎活檢。 其中男 33 例，女 23 例，平均年齡（10.4±0.3） 歲 （3 歲 8 個月-15 歲）， 平均病程 5.3 個月（3天-38 個月）。

HSP 診斷標準：參照《諸福棠實用兒科學》提出的診斷標準： ⑴可觸性紫癜；⑵突發腹痛；⑶病理切片可觀察浸潤的小動脈或者小靜脈中性粒細胞。 （以上指標符合≥2 條可診斷）。 HSPN 診斷標準：符合2009 年中華醫學會兒科學分會腎臟病學組提出的診斷標準[13]：于HSP 病程的6 個月內，出現蛋白尿和(或)血尿。 蛋白尿：符合以下任何一項即被認為是蛋白尿： ⑴一周內3 次尿常規顯示蛋白陽性； ⑵24h 尿蛋白定量＞0.15g； ⑶一周內有3次尿微量白蛋白高于正常參考值的高限。

另取非腎臟疾病死亡病例尸檢切取的腎臟標本4 例作為正常對照組（2 例重癥肺炎，1 例先心，1 例腹膜炎死亡的新鮮標本， 經檢測無腎臟損害，由我院病理科提供）。同時收集56 例HSPN 患者及8 例健康兒童（兒童保健門診健康體檢兒童，均為知情自愿者）的晨尿作尿足細胞Podocalyxin 檢測。

1.2 腎組織和尿中足細胞蛋白Podocalyxin 表達腎臟病理采用 HE 染色、PAS 染色、MASSON 染色及掃描電鏡檢查。 腎組織和尿中足細胞蛋白Podocalyxin 表達采用免疫熒光染色。 若標本為新鮮腎組織， 則按制作冰凍切片。 小鼠抗人單克隆Podocalyxin-like1（3D3）抗體,購于北京中杉金橋生物技術有限公司, 產于美國Santa cruzbiotechnology，INC。 ZF-0312 FITC 標記山羊抗小鼠 IgG，購于北京中杉金橋生物技術有限公司， 原產地美國Zymed 公司。 染料碘化丙啶（PI），購于長沙歐邁生物科技有限公司， 原產地美國Sigma 公司。 SP-9001 免疫組化染色試劑盒， 購于北京中杉金橋生物技術有限公司，由美國Zymed 公司提供。 熒光顯微鏡為日本產Nikon EclipseE400 型。

1.3 結果的觀察方法及判斷 HSPN 病理改變按1975 年國際小兒腎臟病研究協會（ISKDC）制定的分型標準，分為六級。

HSPNⅠ：腎小球輕微異常。

HSPNⅡ：單純系膜增生；分為：（a）局灶/階段；（b）彌漫性。

HSPN Ⅲ：系膜增生，伴有＜50%腎小球新月體形成/節段性病變（硬化、黏連、血栓、壞死），其系膜增生可為：（a）局灶/階段；（b）彌漫性。

HSPN Ⅳ：病變同Ⅲ級，50%-75%的腎小球有上述病變，分為：（a）局灶/階段；（b）彌漫性。

HSPN Ⅴ：病變同Ⅲ級，＞75%的腎小球有上述病變，分為：（a）局灶/階段；（b）彌漫性。

HSPN Ⅵ：膜增生性腎小球腎炎。

腎組織中腎小球足細胞缺失的判斷： 若足細胞蛋白Podocalyxin 陽性熒光信號表達沿腎小球毛細血管壁走行分布均勻、連續，視為表達完整；若分布不均勻或節段消失，則視為表達缺失。 尿液中足細胞蛋白Podocalyxin 的表達在熒光顯微鏡下觀察，可見尿沉渣抗Podocalyxin 抗體熒光染色，足細胞呈圓形或橢圓形、整個細胞呈綠色熒光強度+ +，碘化丙啶復染核呈鮮紅色、圓形較大、居中或偏一側，有時足細胞被包埋在管型中；尿沉渣瑞氏染色顯示紅細胞、白細胞、上皮細胞；而每份標本低倍鏡觀察全片，高倍確認足細胞后攝像計算機儲存，然后選擇全片左上、左下、右上、右下和中間5 個不同部位10 個高倍視野，記錄完整足細胞數。

1.4 圖象分析 每例切片選取5-10 個腎小球進行圖像分析， 分析軟件為CMIAS 2001A 型多功能真彩色病理圖像分析系統(北京麥克奧迪圖像技術有限公司)，計算足細胞蛋白Podocalyxin 陽性染色面積占腎小球面積的百分比及其陽性染色的灰度(灰度值范圍 0-260，0 為黑色，260 為白色) 。

1.5 統計學處理 足細胞蛋白Podocalyxin 在腎組織的表達 （陽性染色面積占腎小球面積的百分比及其陽性染色的灰度值），各組間（Ⅱa、Ⅱb、Ⅲa、Ⅲb、Ⅳa、Ⅳb、Ⅴa、Ⅴb）數值以均數±標準差表示，進行單因素方差分析，應用SPSS（17.0）統計軟件，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 56 例腎穿刺標本病理分型 根據腎組織HE，PAS 以及Masson 染色結果，結合電鏡，共有8 種病理改變，包括紫癜性腎炎（HSPN）Ⅱa 5 例、Ⅱb 5例、Ⅲa 12 例、Ⅲb 9 例、Ⅳa 8 例、Ⅳb 8 例、Ⅴa 5例、Ⅴb 4 例。 見表1。

表1 56 例腎穿刺標本病理分型

2.2 Podocalyxin 在腎組織的表達 采用免疫熒光法檢測Podocalyxin 在HSPN 各病理分級中腎組織的表達，結果顯示正常腎組織及HSPN Ⅱa 腎組織可見足細胞蛋白Podocalyxin 陽性熒光信號表達沿腎小球毛細血管壁走行分布均勻、連續，信號表達強；磷酸鹽緩沖液（PBS）陰性對照腎組織腎小球毛細血管壁無陽性信號表達；HSPN Ⅱb 腎組織可見足細胞蛋白Podocalyxin 陽性熒光信號表達沿腎小球毛細血管壁走行分布均勻、連續,信號表達較強，但毛細血管壁略顯僵硬；HSPN Ⅲa 及HSPN Ⅲb腎組織可見足細胞蛋白Podocalyxin 陽性熒光信號表達有不同程度分布不均勻或節段消失， 信號表達稍弱；HSPN Ⅳa 腎組織可見足細胞蛋白Podocalyxin 陽性熒光信號表達有不同程度分布不均勻或節段消失,信號表達明顯減弱；HSPN Ⅳb 腎組織足細胞蛋白Podocalyxin 陽性熒光信號表達可見明顯分布不均勻或節段消失， 信號表達明顯減弱，新月體形成區或硬化區信號消失；HSPN Ⅴa 腎組織足細胞蛋白Podocalyxin 陽性熒光信號表達可見明顯分布不均勻或節段消失， 信號表達極度減弱， 新月體形成區或硬化區信號消失；HSPN Ⅴb腎組織可見足細胞蛋白Podocalyxin 陽性熒光信號表達分布極度不均勻或大面積消失， 信號表達極弱，硬化區信號消失。

正常對照組、HSPNⅡa 及Ⅱb 三組腎組織Podocalyxin 染色占腎小球面積的百分比和灰度值組間兩兩比較無差異（P＞0.05），而Ⅲa、Ⅲb、Ⅳa、Ⅳb、Ⅴa 及Ⅴb 組腎組織足細胞蛋白Podocalyxin 陽性熒光信號表達從Ⅱb、Ⅲa、Ⅲb、Ⅳa、Ⅳb、Ⅴa 到Ⅴb 依次下降，Podocalyxin 染色占腎小球面積的百分比和灰度值各組間兩兩比較有顯著差異 （P＜0.01）。 見表2 及圖1-10。

表2 正常腎組織及56 例HSPN 腎組織Podocalyxin 的免疫熒光分析結果（±s）

表2 正常腎組織及56 例HSPN 腎組織Podocalyxin 的免疫熒光分析結果（±s）

單因素方差分析：正常組、Ⅱa 及Ⅱb 兩兩相比，P 均＞0.05；Ⅱb、Ⅲa、Ⅲb、Ⅳa、Ⅳb、Ⅴa 及Ⅴb 兩兩相比，P 均＜0.01

分組 例數 陽性面積占腎小球百分比（%）腎小球內陽性染色灰度值184.58±8.79 184.69±8.84 182.48±7.76 163.59±2.12 159.47±2.38 158.42±2.33 121.73±2.52 106.61±7.35 69.73±8.79正常ⅡaⅡbⅢaⅢbⅣaⅣbⅤaⅤb 4 5 5 1 2 9 8 8 5 4 2.29±0.50 2.28±0.52 2.19±0.49 1.85±0.42 1.46±0.36 1.39±0.39 1.01±0.27 0.88±0.15 0.26±0.09

圖1 正 常 腎 組 織Podocalyxin 的表達（免疫熒光×400）陽性熒光信號表達沿腎小球毛細血管壁走行分布均勻、連續，信號表達強

圖2 PBS 陰性對照腎組織的表達（免疫熒光×400）腎小球毛細血管壁無陽性信號表達

圖3 HSPN Ⅱa 腎組織Podocalyxin 的表達（免疫熒光×400）陽性熒光信號表達沿腎小球毛細血管壁走行分布均勻、連續，信號表達較強

圖4 HSPN Ⅱb 腎組織Podocalyxin 的表達（免疫熒光×400）陽性熒光信號表達沿腎小球毛細血管壁走行分布均勻、連續，信號表達較強，但毛細血管壁略顯僵硬

圖5 HSPN Ⅲa 腎組織Podocalyxin 的表達（免疫熒光×400）陽性熒光信號表達有不同程度分布不均勻或節段消失，信號表達稍弱

圖6 HSPN Ⅲb 腎組織Podocalyxin 的表達（免疫熒光×400）陽性熒光信號表達有不同程度分布不均勻或節段消失，信號表達稍弱

圖7 HSPN Ⅳa 腎組織Podocalyxin 的表達（免疫熒光×400）陽性熒光信號表達有不同程度分布不均勻或節段消失，信號表達明顯減弱

圖8 HSPN Ⅳ b 腎 組 織Podocalyxin 的表達 (免疫熒光×400) 陽性熒光信號表達可見明顯分布不均勻或節段消失,信號表達明顯減弱，新月體形成區或硬化區信號消失

圖9 HSPN Ⅴ a 腎 組 織Podocalyxin 的表達 (免疫熒光×400) 陽性熒光信號表達可見明顯分布不均勻或節段消失,信號表達極度減弱，新月體形成區或硬化區信號消失

2.3 尿足細胞Podocalyxin 的表達 采用間接免疫熒光法檢測尿足細胞Podocalyxin 的表達， 可見足細胞Podocalyxin 陽性熒光染色顯示尿足細胞呈圓形或橢圓形、整個細胞呈綠色熒光強度++～+++；以碘化丙啶復染足細胞核顯示尿大鼠足細胞標記蛋白（PCX）的表達，可見復染尿足細胞核呈鮮紅色、圓形較大、居中或偏一側，有時足細胞被包埋在管型中； 結果顯示： 正常對照組尿足細胞均陰性；HSPN Ⅱa 及Ⅱb 組尿中亦未檢出足細胞；12 例HSPN Ⅲa 有 8 例尿足細胞陽性(占 66.7%)，每例檢出足細胞數(6±0.4)；9 例 HSPNⅢb 有 8 例陽性(占88.9%)，每例足細胞數(6±0.6)；8 例 HSPNⅣa 有 7例陽性 (占 87.5%)， 每例足細胞數 (8±1.4)；8 例HSPN Ⅳb 有 8 例陽性(占 100%)，每例足細胞數(7±1.3)；5 例 HSPN Ⅴa 有 4 例陽性(占 80.0%)，每例足細胞數(8±3)；4 例 HSPNⅤb 有 4 例陽性(占 100%)，每例足細胞數(9±3.2)。 見表3 及圖11-12。

表3 正常腎組織及56 例尿足細胞Podocalyxin 的免疫熒光分析結果

3 討論

過敏性紫癜腎炎 （Henoch-Schonlein purpura nephritis，HSPN）是指過敏性紫癜累及腎臟，是由含IgA 的免疫復合物沉積于腎小球所引起的一種循環免疫復合物病，屬繼發性IgA 腎病。1975 年國際小兒腎臟病研究協會（ISKDC）根據病理改變將紫癜性腎炎分為六型（Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型、Ⅴ型、Ⅵ型），其中Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型、Ⅴ型根據系膜增生程度又分為a（局灶性）和b（彌漫性）。 本研究共收集 56 例 HSPN 患兒，其中Ⅱ型 10 例(17.86%)，Ⅲ型 21 例(37.50%)，Ⅳ型 16 例(28.57%)，Ⅴ型 9 例(16.07%)，以Ⅲ型及Ⅳ型為多見，未收集到Ⅰ型及Ⅵ型患者，病理類型與文獻報道相似[14]。

圖11 尿足細胞PCX 的表達(足細胞核碘化丙啶復染×400) 顯示復染尿足細胞核呈鮮紅色、圓形較大、居中或偏一側,有時足細胞被包埋在管型中

圖12 尿足細胞漿PCX 的表達（免疫熒光×400）熒光染色顯示尿足細胞呈圓形或橢圓形、整個細胞呈綠色熒光強度++～+++

在腎小球臟層上皮細胞（足細胞，podocyte）上存在多種特異性標志物， 如Nephrin、Synaptopodin(PP44)、WT-1 、GLEPP-1 、Podocalyxin(PCX)及 C3b受體等[15]，研究發現表達其他幾種標志蛋白的足細胞幾乎都表達PCX， 故通常僅以抗PCX 單克隆抗體用于鑒別足細胞[12]。研究發現足細胞上標志性蛋白Podocalyxin，由腎小球內皮細胞和足細胞合成，初步認為在成熟的足細胞[16]，通過Na/H 交換調控因子(NHERF2) /ezrin 復合體對足細胞骨架形成和維持起重要作用， 它是腎小球主要帶負電荷的蛋白分子，組成基底膜（GBM）電荷屏障，并通過電荷的排斥作用來維持足突間犬牙交錯的空間結構，對腎小球濾過屏障起負調節作用， 同時有可能阻止壁層細胞對足細胞的黏附[17]。 許多研究表明[12,18]，在多種不同腎小球疾病腎組織中表達的足細胞蛋白以PCX 在尿足細胞的陽性表達率最高(73.8%)，故本研究采用足細胞蛋白PCX 作為尿足細胞的特異性診斷。

本研究顯示， 正常對照組、HSPNⅡa 及Ⅱb 組腎組織無異常增殖性或滲出性改變， 其Podocalyxin 陽性熒光信號表達沿腎小球毛細血管壁走行分布均勻、連續，腎組織Podocalyxin 染色占腎小球面積的百分比和灰度值組間比較無差異，且尿中足細胞檢測均陰性， 提示腎小球濾過膜足細胞損傷輕微，無足細胞脫落，腎小球基底膜無明顯結構改變，與光鏡染色相符；而當HSPN 腎小球內出現明顯系膜增殖伴有局灶或廣泛新月體形成或纖維化時， 自HSPN Ⅲa 至Ⅴb 組腎組織陽性熒光信號表達均有不同程度分布不均勻或節段消失，或呈顆粒狀表達，圖象顯示腎小球毛細血管壁染色有不同程度中斷或缺失，Ⅴa 組腎組織熒光信號表達極度減弱，Ⅴb 組腎組織幾乎無足細胞蛋白Podocalyxin 的熒光信號表達，從Ⅱb、Ⅲa、Ⅲb、Ⅳa、Ⅳb、Ⅴa 到Ⅴb 組，其腎組織 Podocalyxin 染色占腎小球面積的百分比和灰度值依次下降 (P<0.01)，且尿中都不同程度檢出足細胞蛋白Podocalyxin，可見尿足細胞漿PCX 熒光染色顯示尿足細胞呈圓形或橢圓形、整個細胞呈綠色熒光強度++～+++，復染尿足細胞核呈鮮紅色、圓形較大、居中或偏一側，有時足細胞被包埋在管型中， 提示腎小球濾過膜有足細胞的嚴重損傷， 腎小球基底膜上的電荷屏障發生改變，腎小球發生明顯結構的異常，與文獻報道的結果一致[19,20]。 局灶節段腎小球硬化(FSGS)和微小病變型腎病綜合征(MCNS)臨床上均可表現為大量的蛋白尿，足細胞可出現明顯的結構變化，但MCNS 的蛋白尿和足細胞改變均為可逆性，而FSGS 則不然。

關于足細胞從GBM 上分離的機制目前尚不完全清楚，細胞骨架蛋白、整合素蛋白(如31 整合素和Dystroglycan)可能在其中起一定的作用[21]，本實驗采用間接免疫熒光法以抗PCX 單克隆抗體對尿沉渣進行染色，也證實尿沉渣中常見的紅細胞、白細胞、上皮細胞都不著色，僅足細胞顯現綠色熒光強度達+++，核復染顯示完整細胞核，表明本實驗方法可用于檢測尿足細胞。Hara 等[22]在多種腎小球疾病患者的尿中找到了足細胞特異性標志蛋白染色陽性的細胞；Petermann 等[23]把 Heymann 腎炎模型大鼠尿中的細胞用來培養, 細胞仍可貼壁存活，且證實這些細胞主要是足細胞，說明活的足細胞可以從GBM 脫落并從尿中排出；同時也提示除細胞凋亡外, 足細胞脫落可能還存在其它原因,如GBM 被基質金屬蛋白酶 ( matrix metalloproteinases，MMPS)或組織蛋白酶等降解破壞[24]，或 GBM被活性氧氧化損傷,或足細胞骨架蛋白發生重組[25],這些都可以削弱足突與GBM 的粘附連接，導致細胞從GBM 上剝離、脫落。

關于HSPN 的臨床和病理間的相互關系，有報道指出，一種臨床類型可有多種病理改變，而某一病理改變又可有不同的臨床表現。 病理類型為輕微改變者臨床多表現為單純蛋白尿； 最初表現為肉眼血尿和 (或) 持續鏡下血尿但無持續大量蛋白尿者，呈Ⅲ級或Ⅲ級以下的腎小球病變；臨床上呈腎炎或腎病表現，或為持續大量蛋白尿者有10%-20%機會患有Ⅳ-Ⅴ級腎小球病變；兼有腎炎-腎病臨床表現者60%患IV-V 級腎小球病變[26]。 HSPN急性期以后，部分患兒呈現慢性進展過程，臨床上表現為持續蛋白尿、高血壓及腎功能逐步減退，病理上呈腎小球硬化改變。 本研究結果顯示，HSPN從病理改變Ⅲ型開始其腎組織足細胞蛋白Podocalyxin 的表達強度出現減弱,隨病理改變程度的進一步加重, 腎組織足細胞蛋白Podocalyxin 的表達強度逐步減弱，直至幾乎消失，同時尿中出現足細胞蛋白Podocalyxin 的表達。

研究發現在HSP 起病后1-6 個月內作第一次腎活檢，腎臟病理分級為Ⅳ-Ⅴ級的患兒，后期隨訪結果顯示幾乎100%預后較好 (正?；蜱R下血尿或蛋白尿<1g/d)，這個出乎意料的結果可能是與早期聯合應用免疫抑制藥有關；而II-Ⅲ級的患兒預后卻很差， 其原因可能是由于作第一次腎活檢的時間太早， 其結果還來不及反映腎臟受損的嚴重程度，當數月至數年后行第二次腎活檢時，都已是Ⅴ級[27]。因此不能僅憑第一次腎活檢結果或某一個影響預后的因素就決定紫癜性腎炎患兒的預后。

本研究結果表明，各病理類型HSPN 檢測尿足細胞蛋白Podocalyxin 陽性者其陽性率無統計學差異，且尿足細胞數大致相等，可能與樣本含量較小有關， 或尿足細胞蛋白Podocalyxin 的表達強度與腎組織本身病理改變的程度并無相關， 其結果有待進一步驗證。 但對于尿足細胞蛋白PCX 染色陽性的HSPN 患者已預示著其病情正處在進展過程中，其腎小球開始出現新月體，并逐步向慢性纖維化進展。 大量研究顯示HSP 病初的臨床表現和腎臟病理改變程度及進展有很大關系， 長期隨訪及合理治療對判斷預后十分重要， 本研究結果顯示尿足細胞蛋白Podocalyxin 的檢測可作為無創評估HSPN 腎臟病理進展的指標之一，可能對病情隨訪追蹤和預后判斷提供幫助。

總之，隨著HSPN 病理改變的加重，足細胞蛋白Podocalyxin 在腎組織的表達呈下降趨勢， 可能提示足細胞損傷在HSPN 病理進展中發揮一定作用。 Ⅲ型以上HSPN 尿足細胞蛋白Podocalyxin 檢測陽性，提示尿足細胞檢測可能反映HSPN 病理損害程度。