白花地膽草和匙羹藤粗提物生物活性初步研究

鐘婷婷，史丹妮，錢小香，黃丹慜，郭霞

（海南省林業(yè)科學(xué)研究院（海南省紅樹(shù)林研究院），海南?？?571100）

白花地膽草（Elephantopus tomentosus L.）別名牛舌草（海南），屬菊科地膽草屬草本植物。分布在中國(guó)西南和華南地區(qū)，尤其是在海南、廣東等地[1]。白花地膽草具有清熱解毒和消炎利尿等作用，用于治療腹瀉、腹痛、濕瘡等；也可治療感冒、肝炎、扁桃體炎等，能去火、傷暑、涼血、利濕消腫等[2-3]。白花地膽草次生代謝物包括倍半萜內(nèi)酯、三萜、酚類、黃酮、甾醇等?；钚苑矫鎿?jù)報(bào)道，白花地膽草除抗腫瘤活性[4]，還對(duì)大腸桿菌、枯草芽抱桿菌和金黃色葡萄球菌有明顯影響[5]。

匙羹藤（Gymnemda sylvestre（Retz.）Schult.）又稱羊角藤、金剛藤，系蘿摩科匙羹藤屬植物[6]。分布在印度、越南及中國(guó)云南、廣東、臺(tái)灣等地區(qū)。全株可入藥，具有收斂、健胃、滋補(bǔ)強(qiáng)壯、清熱等作用，其葉性平、味苦，具祛風(fēng)止痛、生肌消腫之功效[7]。主要次生代謝物有皂苷類、萜類、黃酮、多肽、果膠、生物堿等[8-9]。匙羹藤提取物對(duì)金黃色葡萄菌、大腸桿菌、變形桿菌以及綠膿桿菌等多種細(xì)菌具有抑菌作用[10-12]。

在農(nóng)用活性方面，未見(jiàn)這兩種藥用植物的報(bào)道。為此，開(kāi)展白花地膽草、匙羹藤粗提物的病蟲活性測(cè)試，目的是挖掘具有殺蟲和抑菌的活性物質(zhì)，以便用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)服務(wù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試植物：白花地膽草和匙羹藤采自儋州市和慶鎮(zhèn)拱教村周邊。

供試?yán)ハx：斜紋夜蛾（Spodoptera litura F.）從木瓜樹(shù)上采集斜紋夜蛾卵塊，置于室內(nèi)生化培養(yǎng)箱控溫25℃±2℃孵化，用野生蓖麻葉飼養(yǎng)，待斜紋夜蛾繁殖第2 代時(shí)，分別挑選大小一致的3 齡幼蟲供試；萵苣指管蚜蟲（Dactynotus formosanus Takahashi）采自農(nóng)家菜園萵苣上的蚜蟲。

供試菌種：香蕉炭疽病菌（Colletotrichum musae）、水稻紋枯病菌（Thanatephorus cucumeris）、椰子灰斑病菌（Pestalotia palmarum）香蕉枯萎病菌（Fusarium axysporum）、 芒 果 蒂 腐 病 菌（BatryodiplodiaTheobromae）。以上病原菌由海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 白花地膽草、匙羹藤粗提物的制備

將采集的白花地膽草和匙羹藤置于室內(nèi)，陰干，粉碎，過(guò)40 目篩。然后用甲醇浸提3 次，每次浸提的時(shí)間分別為3d、2d、1d。合并濾液，減壓濃縮，得白花地膽草浸膏和匙羹藤浸膏，置于4℃下備用。

1.2.2 白花地膽草、匙羹藤粗提物的殺蟲活性測(cè)定

采用浸漬法[8]測(cè)定白花地膽草粗提物和匙羹藤粗提物對(duì)斜紋夜蛾3 齡幼蟲的觸殺活性。分別稱取0.1g 白花地膽草粗提物和匙羹藤粗提物，放入燒杯中；用少量丙酮將其濃度配制成質(zhì)量濃度為10mg/mL 的溶液，以印楝素稀釋1500 倍（10mg/mL）為藥劑對(duì)照，清水為空白對(duì)照。選取20 頭3 齡斜紋夜蛾幼蟲，放于紗網(wǎng)中，浸入藥液泡5s；取出后用吸水紙吸取多余藥液，放于培養(yǎng)皿中，用新鮮的蓖麻葉正常飼養(yǎng)。每處理3 次重復(fù)。分別于12h、24h、48h、72h 記錄斜紋夜蛾3 齡幼蟲的死亡情況，按下列公式計(jì)算試蟲死亡率。

采用相同方法測(cè)定白花地膽草和匙羹藤粗提物對(duì)萵苣指管蚜蟲的觸殺活性。于12h、24h、48h 記錄萵苣指管蚜蟲的死亡情況，按下列公式計(jì)算試蟲死亡率或校正死亡率。

死亡率（%）=（試蟲總數(shù)-藥后活蟲數(shù)）/試蟲總數(shù)×100

校正死亡率（%）=（處理組死亡率-對(duì)照組死亡率）/（1-對(duì)照組死亡率）×100

1.2.3 白花地膽草、匙羹藤粗提物的抑菌活性測(cè)定

采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定粗提物的抑菌活性。用少量丙酮和無(wú)菌水將白花地膽草和匙羹藤粗提物配制成100mg/mL 的母液。移取2mL 母液加入到融化的18mL 無(wú)菌PDA 培養(yǎng)基中，搖勻、迅速分裝于3 個(gè)6cm培養(yǎng)皿內(nèi)，冷卻備用，此時(shí)，母液被稀釋10 倍，有效濃度為10mg/mL。以苦參堿稀釋800 倍為藥劑對(duì)照，以少量丙酮和無(wú)菌水作為空白對(duì)照。用5mm 打孔器取靶標(biāo)菌的菌餅，倒置接入到培養(yǎng)基上，28℃±2℃培養(yǎng)2d～5d，十字交叉法測(cè)量菌落直徑，按下列公式統(tǒng)計(jì)抑菌率。

菌落直徑（mm）=菌落平均直徑-5.0

菌絲生長(zhǎng)抑制率（%）=（對(duì)照組菌落直徑-處理組菌落直徑）／對(duì)照組菌落直徑×100

1.2.4 白花地膽草粗提物對(duì)供試病原菌的毒力測(cè)定

將100mg/mL 白花地膽草粗提物母液梯度稀釋，配 置 成 質(zhì) 量 濃 度 為50mg/mL、25mg/mL、10mg/mL、5mg/mL 的溶液，移取2mL 母液加入到融化的18mL無(wú)菌PDA 培養(yǎng)基中，濃度倍稀釋10 倍后，最終濃度為10mg/mL、5mg/mL、2.5mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL。采用生長(zhǎng)速率法測(cè)試同上。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

獲得數(shù)據(jù)采用Duncan 新復(fù)極差法進(jìn)行分析，比較各結(jié)果的差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 白花地膽草、匙羹藤粗提物對(duì)斜紋夜蛾的觸殺活性結(jié)果

采用浸漬法測(cè)定粗提物對(duì)斜紋夜蛾3 齡幼蟲的觸殺活性，結(jié)果如下：

由表1 可知，在10mg/mL 質(zhì)量濃度下，不同時(shí)間段，白花地膽草和匙羹藤粗提物對(duì)斜紋夜蛾3 齡幼蟲的殺蟲活性不理想，其死亡率跟對(duì)照組的死亡率差異不顯著，跟印楝素的死亡率相比差異極其顯著。印楝素為公認(rèn)植物源殺蟲劑，具有顯著的殺蟲活性，這2 種粗提物的活性明顯低于印楝素。

表1 不同時(shí)間粗提物對(duì)斜紋夜蛾的觸殺活性（%）Tab.1 Contact activity of crude extracts at different time to Spodoptera litura (%)

2.2 白花地膽草、匙羹藤粗提物對(duì)萵苣指管蚜蟲的觸殺活性結(jié)果

采用浸漬法測(cè)定粗提物對(duì)萵苣指管蚜蟲的觸殺活性，不同時(shí)間段統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表2：

表2 不同時(shí)間粗提物對(duì)萵苣指管蚜蟲的觸殺活性（%）Tab.2 Contact activity of crude extracts at different time to Dactynotus formosanus（%）

由表2 可知，在10mg/mL 質(zhì)量濃度下，白花地膽草和匙羹藤粗提物均對(duì)萵苣指管蚜蟲表現(xiàn)出較好的觸殺活性。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，萵苣指管蚜蟲的死亡率逐漸升高，受藥48h 后，白花地膽草粗提物處理萵苣指管蚜蟲死亡率達(dá)到70.0%；匙羹藤粗提物處理萵苣指管蚜蟲死亡率達(dá)到62.50%。不同提取物之間比較發(fā)現(xiàn)，白花地膽草與匙羹藤的觸殺力差異不顯著，但二者與印楝素藥劑對(duì)照相比，差異顯著，且觸殺力低于標(biāo)準(zhǔn)藥劑。

2.3 白花地膽草、匙羹藤粗提物抑菌活性測(cè)定結(jié)果

為進(jìn)一步了解粗提物的抑菌活性，測(cè)試了2 種粗提物對(duì)5 種病原靶標(biāo)菌的抑菌活性，結(jié)果見(jiàn)表3。

在10mg/mL 質(zhì)量濃度下，白花地膽草粗提物對(duì)供試菌種的抑菌活性顯著，對(duì)供試菌種的抑制率均在50.00%以上，其中對(duì)香蕉炭疽菌的抑制率最高，達(dá)到75.33%。對(duì)各供試菌種的抑制率從高到低依次是香蕉炭疽菌＞芒果蒂腐菌＞水稻紋枯菌＞椰子灰斑菌＞香蕉枯萎菌。且該粗提物抑菌效果明顯高于對(duì)照，差異極顯著；匙羹藤粗提物對(duì)供試菌種也有較好的抑制作用，抑菌率均高于對(duì)照藥劑，但明顯低于白花地膽草粗提物。

2.4 白花地膽草粗提物的毒力

從表3 得知，白花地膽草對(duì)靶標(biāo)菌表現(xiàn)出顯著的抑菌活性，為了進(jìn)一步測(cè)試該粗提物對(duì)靶標(biāo)菌的毒 力，在 質(zhì) 量 濃 度10mg/mL、5mg/mL、2.5mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL 下，白花地膽草對(duì)供試菌種的毒力結(jié)果見(jiàn)表4。根據(jù)毒力回歸方程的相關(guān)系數(shù)較好，說(shuō)明方程具有一定可信度。方程斜率為正數(shù)，表明隨著濃度增加，白花地膽草粗提物對(duì)供試菌種的抑制率也逐漸增強(qiáng)。對(duì)香蕉炭疽菌、水稻紋枯菌、椰子灰斑菌、芒果蒂腐菌、香蕉枯萎菌的EC50分別是：1.3437mg/mL、4.1812mg/mL、8.2398mg/mL、9.4578mg/mL、16.7976mg/mL。表明，香蕉炭疽菌對(duì)白花地膽草粗提物最敏感，該結(jié)果與表3 結(jié)果一致，同時(shí)表明，該粗提物在香蕉炭疽菌的防治中可能有較好的應(yīng)用前景。

表4 白花地膽草對(duì)5 種病原菌的毒力測(cè)定結(jié)果Tab.4 Determination results of the virulence of Elephantopus tomentosus L.to 5 pathogens

3 討論

初步研究了白花地膽草和匙羹藤粗提物對(duì)斜紋夜蛾和萵苣指管蚜蟲的殺蟲活性以及對(duì)供試菌種的抑制活性。對(duì)斜紋夜蛾3 齡幼蟲觸殺活性不理想，對(duì)萵苣指管蚜蟲具有較好的觸殺活性。對(duì)靶標(biāo)菌有較好的抑菌效果，特別是對(duì)香蕉炭疽病菌抑菌活性顯著。

由于僅測(cè)試了對(duì)斜紋夜蛾和萵苣指管蚜蟲的觸殺活性，該粗提物是否具有拒食活性或者驅(qū)避活性，目前還未證實(shí)。未測(cè)試濃度效應(yīng)對(duì)萵苣指管蚜蟲的殺蟲活性。未涉及各濃度對(duì)供試菌種的菌絲形態(tài)、孢子形態(tài)、產(chǎn)孢量的影響。粗提物中有許多次生代謝物，究竟是哪種物質(zhì)發(fā)揮抑菌活性，目前還不清楚，下一步將利用香蕉炭疽病菌為測(cè)試靶標(biāo)，采用活性追蹤方法，分離白花地膽草中的抑菌活性物質(zhì)，為研究開(kāi)發(fā)植物源殺菌劑做鋪墊。