草莓病毒病、脫毒技術及病毒檢測研究進展

霍辰思 樊新萍 劉偉

摘 要： 針對草莓主要病毒病及其為害特點、草莓脫毒主要技術及病毒檢測技術進行綜述，介紹了近年來草莓脫毒苗繁育技術，以期對草莓生產提供理論指導作用。

關鍵詞： 草莓病毒病;脫毒技術;病毒檢測

文章編號：2096-8108（2020）04-0066-06? 中圖分類號：S668.4? 文獻標識碼：A

Research Advance in Detoxification Technique and Virus Detection of Strawberry Virus Disease

HUO Chensi， FAN Xinping， LIU Wei

（Fruit Tree Research Institute of Shanxi Agricultural University， Taiyuan 030031， China）

Abstract： The injurious characteristics of strawberry virus disease、main technologies of strawberry detoxification and virus detection techniques were summarized in this research. The breeding technique of virus-free strawberry was introduced，in order to provide theoretical guidance of strawberry production.

Keywords： strawberry virus disease; detoxification technology; virus detection

草莓（Rosaceae，Fragaria）在園藝學上屬漿果類果樹，多年生薔薇科草本植物[1]。其資源類型多樣，適應強，栽培面積廣，是一種重要的經濟作物。果肉香甜多汁，含有大量微量元素和維生素，營養價值極高，素有“水果皇后”之美稱，是一種深受大眾喜愛的水果。多以無性繁殖為主，其繁殖方式有匍匐莖繁殖、新莖分株繁殖和離體繁殖。然而，通過傳統繁殖方法并不能有效脫除病毒。很多農業企業只注重產量，對生產中出現的病毒病并沒有得到有效重視。由于多年連作，種性退化嚴重，草莓病毒病嚴重影響產量。其主要表現為植株生長緩慢、葉片皺縮見斑駁、果實畸形品質變差[2]。 目前，草莓斑駁病毒、草莓輕型黃邊病毒、草莓鑲脈病毒、草莓皺縮病毒和草莓潛隱環斑病毒是栽培生產上廣泛侵染草莓的幾種病毒[53]。

草莓同馬鈴薯、甘薯、山藥等無性繁殖植物一樣，一旦感染病毒就會傳染給后代。隨著無性繁殖系數不斷擴大，病毒傳播速度也逐漸加快。草毒植株本身對病毒并沒有免疫能力，目前尚沒有特效方法或外用藥劑可以治愈病毒病，獲得草莓無病毒苗的有效方法仍是通過組培脫毒，得到無病毒原種植株，然后將無病毒苗進行擴繁，從而達到滿足市場的需求量[4]。目前，在草莓病毒脫除方面，熱處理結合莖尖培養脫毒法國內外普遍采用的一種方法[5-6]，但這種方法存在操作時技術難度大、培養周期耗時長、脫毒環境要求高、脫毒苗成活率低等問題。本文通過對草莓病毒病的研究現狀、脫毒技術及病毒檢測鑒定等方面的研究進行綜述，以期對草莓生產起到指導作用。

1 草莓主要病毒病類型

1.1 草莓斑駁病毒（strawberry mottle virus， SMoV）

草莓斑駁病毒又叫草莓輕型皺縮病毒，屬伴生豇豆病毒科（Secoviridae）、（Sadwavirus）病毒屬[2]。病毒粒子形狀為球形，通常存在于植株葉片的表層、韌皮部以及薄壁細胞里。1938年，第1次在英格蘭鳳梨草莓上發現該病毒，存在范疇廣。該病毒屬典型的半持久類蚜蟲傳染，其傳播途徑以草莓釘毛蚜為主，托馬斯毛管蚜、花毛管蚜、棉蚜等蚜蟲皆可傳播。通過嫁接和機械接種進行傳染;不能通過草莓種子傳染，植株間相互觸碰也不會被傳染。感染該病毒草莓的主要癥狀為：葉脈透明水漬化、脈序雜亂，葉片褪綠見斑駁，植株矮化;病癥隨季節變化其表現略有不同或無癥狀，但隨著侵染時間延長，也會導致植株生長勢減弱，產量降低。

1.2 草莓鑲脈病毒 （strawberry vein band virus， SVBV）

草莓鑲脈病毒屬花椰菜花葉病毒科（Caulimoviridae）、花椰菜病毒屬（Caulimovirus）[2]。病毒粒子體積較大，呈球型，沒有包膜。通常于細胞質里進行復制，依附于葉片表面、植株表皮、跟木質部連接的維管束以及細胞質。英國科學家于1952年從美國、巴西等地引進的草莓品種Fairfax上首次發現該病毒，隨后在全球范圍廣泛傳播。它屬于半持久性蚜傳病毒，同草莓斑駁病毒類似，主要通過草莓釘毛蚜進行傳播;鑒于其在傳播媒介里不能進行復制，所以無法通過汁液傳染，也不能通過種子及花粉傳染。研究發現：弗吉尼亞草莓、叢林草莓、智利草莓等被該病毒侵染后植株癥狀為葉脈發黃、葉片邊緣呈不規則黃色、新葉細弱畸形等。由于該病毒來源復雜，不同地域壞境下SVBV基因組分子存在差異，這也導致危害特點、傳播媒介各不相同。

1.3 草莓皺縮病毒 （strawberry? crinkle? virus，SCV）

草莓皺縮病毒屬彈狀病毒科（Rhabdoviridae），細胞質彈狀病毒屬（Cytorhabdovirus）[2]。病毒學家普遍認為草莓潛 A 和潛 B 病毒與SCV 同屬一類病毒。現如今，大范疇存在于國內外，還有著株系分化的情況。病毒粒子形狀呈子彈狀，通常依附在植株表皮、導管跟篩管周圍的軟體組織細胞里。該病毒的傳播媒介通常是草莓釘毛蚜，傳染性持久，可以在昆蟲的體內完成復制，還可以通過接種及嫁接的形式傳播;植株彼此觸碰不會發生傳染，種子跟花粉同樣不會傳播病毒。在生產上主要危害叢林草莓，受其侵染后，花瓣變形缺瓣，植株葉片畸形，葉脈邊緣出現大面積不規則褪綠斑及壞死斑，葉脈由綠色變為水漬透明狀，幼葉生長大小不均，皺縮扭曲，小葉黃化，植株矮化、果實畸形，嚴重制約草莓產量。

1.4 草莓潛環斑病毒（strawberry latent ringspot virus， SLRSV）

草莓潛環斑病毒屬豇豆花葉病毒科（Secoviridae），線蟲傳多面體病毒屬（Nepovirus）[2]。通常存在于歐洲、美國及俄羅斯等國家，中國目前尚未發現該病毒。病毒粒子形狀尚不確定，有文獻報道其粒子形態為球型。主要以長劍線蟲為媒介傳播。主要感染種球、苗木以及塊莖。植株受到病毒侵染后，主要表現為葉片畸形、褪綠黃化;植株矮小、果實品質下降，危害嚴重時可絕產。

1.5 草莓輕型黃邊病毒（strawberry mild yellow edge virus，SMYEV）

草莓輕型黃邊病毒屬甲型線性病毒科（Alphaflexiviridae）、暫定為馬鈴薯Χ病毒屬（Potexvirus）[2]。蘇代發[2]在文獻中闡述，在1992年時，這種病毒首次發現于美國加州，之后澳大利亞、歐洲和日本等地相繼發現此病毒，現如今在國內外廣泛傳播。病毒粒子呈線性，屬單鏈正義RNA。

該病毒傳播媒介通常是草莓釘毛蚜，不能在其他傳播媒介中繁殖。這種病毒單獨侵染危害小，通常是跟其他多種病毒共同侵襲植株。受病毒復合侵染后表現：嫩葉綠色褪除出現黃色斑點，老葉出現壞死條斑，葉片大面積枯死，植株變矮，果實畸形、果品變差，極大程度影響草莓產量。

2 草莓脫毒技術

2.1 草莓莖尖培養脫毒

植物莖尖分生組織由不斷分裂的細胞組成，由于其生長旺盛、細胞分裂快，且在1.0 mm范圍內受病毒浸染小。因此，生產上廣泛使用的方法仍是草莓莖尖脫毒[13]。Belkengren and Miller最早應用組培法獲得了草莓無病毒苗，法國學者Morel[14]證明已感染病毒的植株通過莖尖分生組織培養，可以恢復成無病毒植株。莖尖大小直接影響著脫毒效果，由于病毒廣泛存在于無維管束的分生區域內，需依靠胞間連絲進行傳遞，莖尖分生區域的細胞分裂、生長速度較快，病毒的傳遞速度較莖尖分生細胞慢，所以生長點病毒含量最低[15]。然而，組培中剝取莖尖大小直接影響其脫毒率，莖尖越小脫毒率越高，而成活率卻有所降低，且剝取范圍越小操作難度越大。因此，掌握合適的剝取范圍對脫毒率和成活率至關重要。沈磊、童堯明[51]等切取草莓莖尖分生組織0.2～0.4 mm進行組培，出苗率為83%～90%，脫毒率高達100%。高山林[16]把切取的草莓芽沖洗后，通過高溫、短時間快速熱處理，用莖尖培養法獲得無病毒草莓苗。高遐虹[17]在試驗中采用二次脫毒方法：即第1次不剝離莖芽的苞葉，直接切割莖尖進行組培脫毒，將培養2個月后的組培苗從瓶中取出，再次切取0.4～0.6 mm的莖尖進行第2次脫毒培養，獲得分化率和脫毒率分別為79.2%和84.5%的草莓脫毒苗。何歡樂[18]等研究表明：取大約0.5 mm莖尖進行二次脫毒培養，脫毒率高達100%，但成活率卻大大降低為26%。綜合前期研究表明，采用莖尖脫毒，莖尖大小通常控制在0.2～0.4 mm左右，脫毒率最高。若熱處理時間過長，會阻礙莖尖正常生長，導致存活率下降。綜上所述，傳統莖尖培養及二次脫毒莖尖培養技術雖是獲得無毒苗的有效手段，但存在操作復雜耗時長、工作效率低的問題。因此，摸索出一套高效、快捷、簡便的脫毒方法至關重要。

2.2 熱處理脫病毒

自然界大多數的病毒粒子都有不耐高溫特性，熱處理脫毒就是利用高溫能使病毒粒子失活，達到滅活效果[21]。熱處理包括熱水處理和熱氣處理，目前脫毒效果較好的方法是利用恒溫或變溫的熱空氣處理帶病植株，剪取熱處理后長出的新芽進行嫁接或進行組織培養，得到無病毒的草莓原種植株。肖君澤[19]通過37～38 ℃恒溫或35～38 ℃變溫處理草莓莖尖，有效降低熱處理后植株死亡率。廖俊杰[20]等將育苗缽培養的草莓苗于38 ℃恒溫箱處理15 d后并沒有脫除病毒，處理90 d后脫毒率僅為66%。劉健[21]在文獻中表述莖尖在 40 ℃與42 ℃水浴處理的脫毒率均可達100%，綜合考慮成活率與脫毒率，熱處理溫度以40 ℃為好。

2.3 化學試劑脫毒

化學療法脫毒就是利用化學試劑在植物體內可以延遲或是抑制病毒復制，從而使植物擺脫病毒的一種外界干預法。該方法對莖尖大小要求不高，無需特定范圍的莖尖也能得到較好的脫毒效果。對于化學藥劑處理脫毒的機制尚未有很深入的研究，目前植物脫毒的化學試劑主要有三氮唑核苷（病毒唑）、5-二氫尿嘧啶（DHT）、放線菌素、堿性孔雀綠及環乙酰胺等，其中病毒唑是應用最廣的化學試劑。1953-1954年，D.Norris最早將孔雀綠用于馬鈴薯無病毒苗培育，脫掉了馬鈴薯X病毒，獲得了馬鈴薯無病毒苗。廖俊杰[20]等采用培養基化學療法和田間化學療法進行對比試驗，在培養基中加入化學試劑后切取適當莖尖進行組培，獲得比對照（田間化學療法）高70%的脫病毒率。秦梅[22]在甘薯脫毒培養基中加入10 mg/L的三氮唑核苷后，脫毒率可達到76%。Cassells[23]等將病毒唑加入培養基中，通過組培可脫除馬鈴薯多種病毒。通過化學療法雖然能得到脫病毒植株，但是會有輕度藥害現象發生。有研究表明其毒性會遺留在新生植株內，隨后進入人體，與現在提倡的綠色環保無公害作物相駁。出于安全實效性考慮，很難在生產中推廣應用。

2.4 熱處理與莖尖培養相結合脫毒

利用傳統的熱處理脫毒，由于莖尖在高溫、高濕環境下處理時間過長，植株易枯死、容易受紅蜘蛛、蚜蟲等昆蟲危害。且不同病毒對高溫的耐受性不同，單純依靠熱處理并不能有效脫除病毒。而熱處理與莖尖培養相結合比常規脫毒效果更好，目前該技術在生產上普遍使用。王際軒[24]將生長旺盛的草莓盆栽苗于38～40 ℃溫度下熱處理42 d，選取熱處理后大小合適的莖尖進行組織培養，脫毒率能達到70%左右。何歡樂[46]在草莓莖尖培養脫毒效果研究中采用改良熱處理莖尖培養法，先將草莓匍匐莖于40 ℃水浴處理4 h后，剝取 0.5～0.6 mm左右的莖尖進行培養，獲得47.37%莖尖成活率。劉健[21]在試驗中設計40 ℃和42 ℃兩個溫度梯度，處理后的莖尖脫毒率均可達到100%，但鑒于時間長短對莖尖有影響力，一般采用40 ℃處理4h為宜。李志強[25]等以草莓品種“紅顏”、“章姬”為試材，篩選出莖尖誘導培養最佳培養基配方為MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.02 mg/L，并建立其組培快繁 體系。顧地周[26]采用均勻設計法，將已感染了斑駁病毒和皺縮病毒的草莓試管苗在試管內誘導匍匐莖，再將帶有匍匐莖的試管苗直接進行56 ℃高溫處理后，切取1 mm的莖尖在LS+6-BA 1.00 mg/L+GA3 1.90 mg/L+KT 1.00 mg/L培養基進行培養，通過病毒檢測和栽培觀察可知，脫毒率高達100%。

2.5 超低溫脫毒

超低溫脫毒是一種新型高效脫毒技術，較傳統脫毒法而言，其脫毒效率更高，且對莖尖大小無要求。超低溫冷凍療法是兼植物種質資源保護與脫毒雙重作用的一種脫毒方法，其作用原理是[27]：利用莖尖分生組織細胞與分化細胞結構上的差異進行脫毒。由于莖尖分生組織細胞體積較小、液泡小和較大核質體積比等特點，脫水更容易，在液氮環境中不易被凍死;而莖尖分化細胞體積較大，含有較大的液泡和較小的核質比，脫水處理較難，在超低溫環境下易被凍死。此外，莖尖分生組織病毒含量少，而分化組織往往是病毒富集區。因此，當液氮處理分生組織后，受傷死亡的細胞大部分都是分化細胞，而保留下來的不含病毒分生組織，可通過組織培養獲得無病毒植株[27]。Brison等（1997）首次運用超低溫脫毒法脫除李痘包病毒（Plum pox virus，PPV），獲得李無病毒植株。此后，超低溫冷凍療法開始普遍應用于植物脫毒。目前，超低溫脫毒技術已經在百合[28]、甘薯[29]、馬鈴薯[30]、黃瓜[31]、葡萄[29]、柑橘[32-33]、香蕉[31]、櫻桃[34]、獼猴桃[35]等植物脫除病毒上廣泛應用，對于草莓研究報到較少。羅婭[37]優化超低溫脫除體系，草莓的莖尖存活率為69%，多種草莓病毒被脫除，脫除率高達100%。盛宏亞[38]以攜帶草莓斑駁病毒（SMoV）“紅顏”為供試材料，建立預防“紅顏”草莓的莖尖玻璃化超低溫脫毒體系。利用RT-PCR技術檢測草莓斑駁病毒的脫毒效果，脫毒率為100%。陳曦[39]以“福莓1號”為試材，利用莖尖超低溫冷凍脫毒技術將外植體低溫鍛煉2周后，莖尖在預培養基上暗培養 3 d，1/2濃度 PVS2溶液及全濃度PVS2溶液冰上冷處理2次，液氮冷凍 1 h后，在39 ℃的水浴中快速化凍2? min，卸載后莖尖先暗培養3 d后轉入正常光照培養，再生培養成活率約30%，病毒脫除率為100%。

3 草莓無病毒苗鑒定與繁殖

3.1 草莓病毒病檢測方法

采用上述脫毒技術獲得的草莓苗并不一定能夠完全脫毒，因此需要對脫毒后的草莓苗進行病毒檢測。無病毒苗的鑒定主要有生物學鑒定、血清學檢測法、電鏡檢測法等[47]。目前，分子PCR 技術也被廣泛應用到草莓病毒檢測中[40]。生物學鑒定法又稱指示植物檢測法，是最早應用于植物病毒檢測的方法，目前仍被廣泛應用[47]。該檢測方法可以直接觀察到檢測結果，無需特定儀器設備，操作簡單易掌握。不過檢測時間耗時長，受外界環境因素影響大，容易出現檢測結果的假陽性，降低其檢測的靈敏度[48]。血清學病毒檢測法應用較早，該方法利用抗原與抗體的特異性反應，來鑒定植物是否攜帶病毒[49]。常見的血清學檢測方法有沉淀反應、凝聚反應（VBA）、酶聯免疫的吸附法（ELISA）、免疫熒光技術（IFA）、斑點免疫測定法（DIBA）以及免疫膠體金技術（GICT）[49]等，這些方法具有較高的檢測靈敏性，能夠快速的檢測到草莓病毒，操作也相對簡易方便。但由于其檢測時常依賴血清的品質，可被鑒定的病毒種類受到限制。目前僅有少部分果樹病毒的抗血清可被利用，草莓病毒檢測中，只有草莓輕型黃斑病毒和草莓皺縮病毒抗血清制備成功[50]。電子顯微鏡技術在生物學、細胞學、病毒學等多個生命科學領域發揮重要作用，不僅能夠直觀、準確的觀察到植物表面特征，還可以對病毒機理進行深入的內在挖掘。由于設備價格昂貴，對實驗人員操作技術要求高，并沒有廣泛應用到植物檢測實際工作中。但電子顯微技術作為輔助檢測技術，在分子生物學領域發揮著不可磨滅的作用[41]。分子生物學檢測法以核酸分子雜交為基礎，成為當前病毒檢測最主要方法。因其檢測時靈敏度高、特異性強，不受季節、外界環境影響，采樣后可隨時進行大批量檢測，發揮著血清學檢測法及傳統病毒檢測法無法比擬的優勢。目前，反轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）檢測法、以RNA分子轉錄為基礎的NASBA檢測法、核酸雜交技術和基因芯片技術等是分子生物學檢測的常用手段[3]。

3.2 草莓脫毒苗繁育技術

草莓脫毒苗較傳統繁殖方式有較大優勢，其在植物學性狀、果實品質、豐產性等各項指標均優于普通繁殖苗。大量研究表明，栽培無病毒的草莓苗，能夠提高草莓的質量。草莓果實著色正常，果形整齊，畸形果率降低[19]。這些都為草莓優質、商品化生產提供有力保障。在現代化草莓種苗擴繁基地，脫毒苗的組織培養為種苗生產發揮關鍵性作用[52]。在脫毒快繁過程中不僅要提高組培苗的增殖率和成活率，還要求對培養基濃度、培養容器種類及凝固劑種類等進行優化篩選，在保證種苗生產質量的基礎上達到降低生產成本，找到節能、環保、高效的繁育技術。張恒[42]等用蛭石 + IBA 溶液作為草莓大苗沙盤生根培養基，利用保鮮膜對沙盤進行保濕，可保障草莓繼代培養的大苗在沙盤里生根。將該技術應用于草莓脫毒苗的擴繁，可節約大量成本。謝文申[43]以脫毒野薄荷試管苗為外植體，用30 g/L食用白糖代替蔗糖、用涼開水代替蒸餾水配置淺層液體培養基，比普通固體培養基節約成本 57.44%。張春芬[44]為降低草莓脫毒組培苗的生產成本，用白砂糖替換蔗糖、卡拉膠替換瓊脂粉，總成本降為原來的 32.5%。采用帶塑料瓶蓋的玻璃瓶，可大大節省勞動力，提高生產效率。另外，隨著生物技術發展，脫毒草莓苗的培育更傾向于集生物工程、病毒學檢測和快繁農藝技術為一體的栽培模式，應將這一高新技術系統化、高效化、實用化的應用到草莓生產中。

4 展望

近年來，隨著綠色生態種植農業的蓬勃發展，草莓種植面積逐年增加。由于其生長周期短、采摘方便，草莓生態園自助采摘模式已成為深受市場青睞的一項新型產業。脫毒草莓苗在生產上的應用，極大提高了種植者積極性。而草莓病毒病嚴重制約草莓高產優質進程，重茬種植造成草莓品種單一、種性退化。為了滿足市場上草莓周年供應，建立完善的種苗繁育體系、標準化草莓病毒檢測中心[40]，從源頭上管控草莓病毒，引進脫毒成功的草莓品種尤為重要。由于草莓病毒病多為復合型病毒感染，單一應用傳統的脫毒方法并不能達到良好的脫毒效果，生產上應該采取多種脫毒方法混合使用。隨著基因工程的發展，生物技術的廣泛應用為草莓脫毒及無病毒苗鑒定開辟了新的途徑。目前，草莓脫毒苗繁育體系雖然有了一定的發展，但是組培快繁技術成本高、操作環節嚴謹難度大、資源浪費嚴重，需進一步探索符合生產實際、節能環保高效的繁育體系，促進草莓業健康發展。

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