84消毒溶液對(duì)生物實(shí)驗(yàn)室廢棄細(xì)胞殺滅作用

吉新華，沈西華，鄒 泓

（石河子大學(xué) 醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，第一附屬醫(yī)院病理科，新疆 石河子 832000）

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)是現(xiàn)代生物實(shí)驗(yàn)中一個(gè)重要組成部分，培養(yǎng)條件要求比較苛刻，在進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)時(shí)面臨的 2個(gè)常見(jiàn)問(wèn)題是細(xì)胞滅活和細(xì)胞污染。目前，國(guó)內(nèi)大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室對(duì)于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中廢棄細(xì)胞的處理大都是直接排放進(jìn)下水道，容易造成環(huán)境污染，對(duì)周?chē)巳旱慕】翟斐蓾撛谕{，且國(guó)內(nèi)未見(jiàn)用于活細(xì)胞滅活的市售制劑以及相關(guān)實(shí)驗(yàn)和方法的報(bào)道。其次大部分實(shí)驗(yàn)室的消毒仍然使用75%酒精、新潔爾滅、甲醛熏蒸等，尤其是超凈臺(tái)的消毒方法大多為擦拭75%酒精后用紫外線照射30 min。但是由于某些細(xì)胞的生命力較強(qiáng)，仍然存在消毒不徹底導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的交叉污染，引起細(xì)胞的變異并影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果[1]，因此有必要探討新型生物實(shí)驗(yàn)室廢棄細(xì)胞滅活方法，進(jìn)而改良目前細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室消毒流程。84消毒液主要用于各種物體表面和環(huán)境等的消毒[2]，是一種含氯消毒劑，其作用機(jī)制是通過(guò)細(xì)胞壁對(duì)細(xì)菌芽胞、甲乙肝病毒等多種病毒[3]、副溶血性弧菌[4]、結(jié)核分枝桿菌[5]進(jìn)行殺滅作用。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)細(xì)胞增殖研究梯度濃度的 84溶液對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，提出一種新型、廉價(jià)有效的生物實(shí)驗(yàn)室廢棄細(xì)胞的滅活方法，并針對(duì)現(xiàn)有細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室消毒方法進(jìn)行改良，更好地減少生物實(shí)驗(yàn)室的污染。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑和耗材

1640（GIBCO中國(guó)）、DMEM（GIBCO中國(guó)）、胰蛋白酶含0.25% EDTA消化液（北京索萊寶公司）；PBS（上海生工公司）；胎牛血清（以色列Bidnd公司），15 mL 離心管（美國(guó) Corning公司）；1 000、200、10 uL槍頭（麥斯諾品牌）；96孔板（江蘇海貍）；CCK8試劑（日本同仁）；25 cm2培養(yǎng)瓶；無(wú)粉乳膠手套（Biosharp公司）；青霉素鏈霉素的混合液（北京索萊寶公司）；1.5、2、5 mL EP管（南通海之星實(shí)驗(yàn)器材公司）。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

Cu-420型電熱恒溫水箱（上海一恒科技有限公司），371型CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher公司），SW-CJ-1F型超凈工作臺(tái)（中國(guó)上海博訊公司），1 mL、200 uL、10 uL 移液器（德國(guó) Eppendorf公司），TDL-50B型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），LX-100手掌型離心機(jī)（江蘇其林貝爾儀器制造有限公司），xMark酶標(biāo)儀（美國(guó)BIO-RAD公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

待細(xì)胞復(fù)蘇后從37 ℃、含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出待處理的細(xì)胞，放置在熒光倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)成致密單層，融合度基本達(dá)到80%～90%且狀態(tài)良好時(shí)，用胰蛋白酶將細(xì)胞消化之后，進(jìn)行鋪板及其他后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

將融合度基本達(dá)到80%～90%且狀態(tài)良好的786-0細(xì)胞株，用胰蛋白酶將細(xì)胞消化之后進(jìn)行鋪板。鋪96孔板分為10組，每組鋪5個(gè)復(fù)孔以去掉最大值和最小值，每個(gè)復(fù)孔鋪1×104個(gè)細(xì)胞。然后將細(xì)胞放于37 ℃、含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，將各組的細(xì)胞的培養(yǎng)基換成含有梯度濃度的84消毒液的水溶液（表1）后，放入培養(yǎng)箱反應(yīng)1和5 min后在每個(gè)復(fù)孔加入10 uL的CCK-8反應(yīng)1 h后再檢測(cè)其增殖情況。且后期通過(guò)在腎癌細(xì)胞系(ACHN)、食管癌細(xì)胞（109、9706）、滑膜肉瘤細(xì)胞（SW982）、橫紋肌肉瘤癌細(xì)胞株（RD）、卵巢癌細(xì)胞株（A2980）中進(jìn)行CCK-8實(shí)驗(yàn)以此確定不同 84消毒劑殺滅細(xì)胞的最佳濃度以驗(yàn)證之前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.3 細(xì)胞成像

在786-0細(xì)胞株融合度基本達(dá)到80%～90%且狀態(tài)良好時(shí)，將細(xì)胞用胰蛋白酶消化之后進(jìn)行鋪板。鋪12孔板分為10組，每組鋪1個(gè)復(fù)孔，每個(gè)復(fù)孔鋪2×105個(gè)細(xì)胞。然后將細(xì)胞放于37 ℃、含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后觀察各組細(xì)胞的形態(tài)及拍照。待拍完照之后，將各組細(xì)胞的培養(yǎng)基換成含有梯度濃度的84消毒液的水溶液（表1），放入培養(yǎng)箱反應(yīng)1 min后再觀察各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的形態(tài)并拍照。

表1 滅活液中84原液與水的配比

1.2.4 應(yīng)用

SPSS2.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，P＜0.05時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

與對(duì)照組相比，隨著 84水溶液濃度的增加對(duì)細(xì)胞的抑制率逐漸增加直到平臺(tái)期，且由抑制曲線可以看出反應(yīng)1 min時(shí)，84水溶液濃度為100 mg/L時(shí)處于平臺(tái)期，對(duì)細(xì)胞抑制率最高；反應(yīng)5 min時(shí)，84水溶液濃度為60 mg/L時(shí)細(xì)胞處于平臺(tái)期（圖1），對(duì)細(xì)胞的抑制效率最高（P＜ 0.05）。

2.2 細(xì)胞成像

反應(yīng)1 min后，84消毒液處理組與對(duì)照組相比，細(xì)胞密度變小，形態(tài)發(fā)生改變，隨著84消毒劑濃度的遞增，細(xì)胞數(shù)量及形態(tài)發(fā)生更為明顯的變化，直至84消毒劑濃度為 100 mg/L的處理組里面細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生完全崩解（圖2）；反應(yīng)5 min后，84消毒液處理組與對(duì)照組相比，細(xì)胞密度變小，形態(tài)發(fā)生改變，隨著84消毒劑濃度的遞增，細(xì)胞數(shù)量及形態(tài)發(fā)生更為明顯的變化，直至84消毒劑濃度為60 mg/L的處理組里面細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生完全崩解（圖3）。

2.3 84消毒劑對(duì)其他腫瘤細(xì)胞的影響

通過(guò)腎癌細(xì)胞(ACHN)、食管癌細(xì)胞（109、9706）、滑膜肉瘤細(xì)胞（SW982）、橫紋肌肉瘤癌細(xì)胞株（RD）、卵巢癌細(xì)胞株（A2980）在 1 min反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，確定84消毒劑的水溶液最佳殺滅細(xì)胞濃度為100 mg/L，P＜ 0.05（圖 4）。

2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，作用1 min后，84消毒液對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷力最佳濃度為100 mg/L；作用5 min后，84消毒液對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷力最佳濃度為 60 mg/L。為了更迅速、更有效達(dá)到殺滅細(xì)胞的目的，本文推薦濃度為100 mg/L 84消毒液短時(shí)間用于細(xì)胞室超凈臺(tái)的消毒和廢棄細(xì)胞處理，即消毒劑84消毒劑：水為1∶499，反應(yīng)1 min。此方法可以作為一種細(xì)胞室消毒方法，特別是超凈臺(tái)與細(xì)胞培養(yǎng)箱的消毒（消毒超凈臺(tái)順序可為100 mg/L的84消毒劑、75%酒精和紫外照射 30 min）和廢棄細(xì)胞的處理，應(yīng)用于日常實(shí)驗(yàn)。

圖1 腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞株786-0加入梯度濃度的84消毒劑在反應(yīng)1、5 min后的抑制率，其中A、B分別顯示的是加入梯度有效氯含量的84消毒溶液后反應(yīng)1、5 min后的抑制率

圖2 梯度濃度的84消毒液作用1 min后對(duì)腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞株（786-0）細(xì)胞形態(tài)的影響（A）、（B）、（C）、（D）、（E）、（F）分別是加入有效氯為 0、20、40、60、80、100 mg/L 的 84 消毒溶液之前的細(xì)胞形態(tài)；（a）、（b）、（c）、（d）、（e）、（f）分別是加入有效氯為0、20、40、60、80、100 mg/L的84消毒溶液之后的細(xì)胞形態(tài)

圖3 腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞株（786-0）反應(yīng)5 min前后細(xì)胞形態(tài)變化。其中（A）、（B）、（C）、（D）、（E）、（F）分別是加入有效氯為 0、20、40、60、80、100 mg/L 的 84 消毒溶液之前的細(xì)胞形態(tài)；（a）、（b）、（c）、（d）、（e）、（f）分別是加入有效氯為0、20、40、60、80、100 mg/L的84消毒溶液之后的細(xì)胞形態(tài)

圖4 梯度有效氯濃度的84消毒溶液反應(yīng)1 min對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的影響

3 結(jié)論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室管理存在的主要問(wèn)題是沒(méi)有采用正確的方法處理廢棄物，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后直接將廢棄物倒入下水道[6]。對(duì)于這些細(xì)胞實(shí)驗(yàn)過(guò)程中產(chǎn)生的生物活性材料及其代謝物，比如培養(yǎng)的細(xì)胞、微生物及其培養(yǎng)物等[7]，如不加以妥善處置，必然對(duì)環(huán)境和人類(lèi)健康產(chǎn)生很大危害[8]。

本實(shí)驗(yàn)確定了平時(shí)最常見(jiàn)的消毒劑（84消毒劑）在1 min內(nèi)最佳的殺滅細(xì)胞的濃度為100 mg/L，來(lái)殺滅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)在操作過(guò)程中遺留在細(xì)胞間尤其是超凈臺(tái)和無(wú)菌室的細(xì)胞，從而減少細(xì)胞間的交叉污染，同時(shí)還可以用來(lái)殺滅實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的廢棄細(xì)胞以減少生物污染，是一種細(xì)胞滅活、減少細(xì)胞交叉污染的辦法。