生物特色的制藥工藝綜合實(shí)驗(yàn)

蔣 敏，劉 朋，李 恒，李 會(huì)，史勁松

（江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214000）

藥食用真菌多糖是一種從藥食用真菌的子實(shí)體、菌絲體或發(fā)酵液中分離得到的，由10個(gè)以上單糖單元構(gòu)成的天然高分子聚合體。研究表明，藥食用真菌多糖不僅來(lái)源廣泛、安全性良好，還具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、降血糖血脂等多種生理活性，因此在醫(yī)藥學(xué)和食品科學(xué)領(lǐng)域受到了廣泛關(guān)注[1-3]。目前，市場(chǎng)上已有多個(gè)品種的藥食用真菌多糖來(lái)源的藥品和保健品，如靈孢注射液、香菇多糖片等。

灰樹花又名栗子蘑，日本稱舞茸，其香味濃郁、質(zhì)地脆嫩，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，在我國(guó)有悠久的食用歷史[4]。本學(xué)院生物制藥研究室致力于灰樹花真菌深層發(fā)酵以及藥理學(xué)應(yīng)用開發(fā)，建立了穩(wěn)定的發(fā)酵與提取工藝[5-7]。依托于該成果，圍繞生物特色，將微生物發(fā)酵與制劑技術(shù)、藥理學(xué)評(píng)價(jià)相結(jié)合，開設(shè)了制藥綜合性實(shí)驗(yàn)，旨在彰顯我院生物制藥特色，促進(jìn)學(xué)生掌握生物制藥基本技術(shù)并提高綜合科研素養(yǎng)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

灰樹花的深層發(fā)酵培養(yǎng)以及粗多糖參考崔鳳杰等[4-5]的方法。

培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基（成分g/L）：馬鈴薯200，葡萄糖 20，蛋白胨 2，KH2PO42，MgSO4·7 H2O 1，瓊脂20。

種子培養(yǎng)基（成分g/L）：葡萄糖20，蛋白胨2，KH2PO42，MgSO4·7 H2O 1，麩皮浸汁 50。

發(fā)酵培養(yǎng)基（成分g/L）：葡萄糖30，蛋白胨4，KH2PO44，MgSO4·7 H2O 2，玉米漿 1.5。

15 L發(fā)酵罐發(fā)酵擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為25 ℃，通氣量0.75 vvm，攪拌轉(zhuǎn)速80 r/min，裝液量60%，發(fā)酵時(shí)間為10 d，發(fā)酵結(jié)束后，離心，收集沉淀，去離子水清洗3次，稱取濕菌體，提取溫度89.7 ℃，時(shí)間2.48 h，水料比31.1∶1，組織粉碎機(jī)勻漿，熱水加熱浸提，取上清，真空濃縮后按比例加入95%乙醇，4 ℃攪拌過(guò)夜，離心收集醇沉物，真空60 ℃干燥至恒重，備用。

灰樹花（Grifola frondosa GF9801）為本學(xué)院研究室保藏菌種；四氧嘧啶（160 mg/kg BW ip），用前新鮮配置；血糖試紙。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

血糖儀；蒸汽滅菌鍋；搖床；15 L發(fā)酵罐；生化培養(yǎng)箱；三維混勻儀；搖擺式制粒機(jī)；烘箱；真空干燥箱；壓片機(jī)；電子天平；脆碎度儀；崩解儀；紫外分光光度計(jì)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

ICR雄性小鼠（20±2 g），由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物責(zé)任有限公司提供，飼養(yǎng)溫度23 ± 2 ℃，相對(duì)濕度50 ±5 ℃，自由進(jìn)食和飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 灰樹花咀嚼片的制備

1）工藝流程。

原輔料粉碎—過(guò)篩—原輔料按比例混合—制軟材—制粒—干燥—整粒—混合—壓片。

2）配方比例。

赤蘚糖醇 35%，灰樹花粗多糖 60%，微晶纖維素5%。

3）工藝操作要點(diǎn)。

將灰樹花粗多糖、赤蘚糖醇、微晶纖維素等原料過(guò)粉碎機(jī)，過(guò)80目篩，按照配方比例稱量后三維混勻儀混合15～20 min。將物料充分混勻后，70%乙醇作為黏合劑，攪拌混勻，18目篩制粒。將濕顆粒均勻分散在托盤上，烘箱烘干，直至顆粒水分控制在3 %以內(nèi)。將顆粒過(guò)篩整粒，去除較小和較大的顆粒，按照配方加入0.1%硬脂酸鎂，充分混勻。用自動(dòng)壓片機(jī)壓片，制得規(guī)格為每片1.0 g的咀嚼片。

2.2 片劑質(zhì)量測(cè)定

1）外觀檢查。[8]

取咀嚼片20片，平鋪于白底板上，置于75 W光源下60 cm處，距離片劑30 cm，以肉眼觀察30 s。檢查結(jié)果應(yīng)符合下列規(guī)定，完整光潔，色澤一致；80～120目色點(diǎn)應(yīng)＜5%，麻面＜5%，中藥粉末片除個(gè)別外應(yīng)＜10%，并不得有嚴(yán)重花斑及特殊異物。

2）片重差異。[8]

取咀嚼片20片，精密稱定并記錄總質(zhì)量，計(jì)算平均片質(zhì)量，比較每片質(zhì)量與平均片質(zhì)量，超出重量差異限度（±5%）的咀嚼片不得多于 2片，并不得有 1片超出重量差異限度的1倍。

3）崩解時(shí)限。[8]

取咀嚼片6片，分別置六管吊籃的玻璃管中，每管各加1片，準(zhǔn)備工作完畢后，進(jìn)行崩解測(cè)定。

4）脆碎度測(cè)定。[9]

取20片咀嚼片，精密稱定總重量，放入振蕩器中振蕩，到規(guī)定時(shí)間后取出，用篩子篩去細(xì)粉和碎粒，稱重后計(jì)算脆碎度。

5）有效成分含量測(cè)定。

參考苯酚-硫酸法測(cè)定總糖含量。咀嚼片研磨，加入去離子水溶解，配置成 2 mg/mL溶液，吸取樣品1 mL，加入5%苯酚1.0 mL，搖勻，再加5 mL濃硫酸，搖勻，靜置冷卻后于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度[10]。

2.3 降糖效果評(píng)價(jià)

1）造模實(shí)驗(yàn)方法。

動(dòng)物禁食24 h后，參考文獻(xiàn)方法[11-12]，給予四氧嘧啶造模，3 d后過(guò)夜禁食，測(cè)血糖，血糖值 10～25 mmol/L為高血糖模型成功動(dòng)物。

2）分組及處理。

選高血糖模型動(dòng)物按過(guò)夜禁食血糖水平分成 3組，每組10只，隨機(jī)分組如下：糖尿病組與對(duì)照組，給予等量生理鹽水灌胃；治療組，咀嚼片研碎并加水溶解制成每組10只。

3）空腹血糖實(shí)驗(yàn)。

劑量組給予咀嚼片粉末混懸液（咀嚼片研磨研磨成粉，去離子水制成混懸液），灌胃劑量為0.3 g·kg-1·d-1，模型對(duì)照組和正常對(duì)照組均給予同體積溶劑，連續(xù)灌胃給藥2周，每天記錄小鼠體重、飲食量與飲水量，每周定期測(cè)空腹血糖，比較各組動(dòng)物血糖值及血糖下降百分率。

血糖下降百分率=（實(shí)驗(yàn)前血糖值-實(shí)驗(yàn)后血糖值）/實(shí)驗(yàn)前血糖值×100%。

4）口服糖耐量實(shí)驗(yàn)（OGTT）。

14 d后，小鼠禁食過(guò)夜后經(jīng)口給予葡萄糖溶液（劑量為2.0 g·kg-1BW），測(cè)定0、0.5、1、2 h的血糖值，觀察各組動(dòng)物給予葡萄糖后各時(shí)間點(diǎn)血糖水平及曲線下面積的變化。

血糖曲線下面積（AUC）=15×（0 h血糖值+0.5 h血糖值）+15×（0.5 h血糖值+1 h血糖值）+15×（1 h血糖值+2 h血糖值）。

3 結(jié)果與分析

3.1 咀嚼片質(zhì)量檢查

制得的咀嚼片形狀完整，表面光滑，色澤均勻，具有灰樹花的特有香氣。重量差異、脆碎度、硬度、水分均合格，粗多糖含量為（5.6±0.2）% /片。

3.2 造模情況

按照實(shí)驗(yàn)規(guī)范，將實(shí)驗(yàn)用 ICR系雄性小鼠禁食24 h（不禁水），一次性腹腔注射四氧嘧啶溶液（生理鹽水溶解，一次性腹腔注射給藥160 mg/kg，3 d后尾尖取血測(cè)定小鼠空腹12 h的血糖，記錄數(shù)值，將給藥造模3 d后的空腹血糖值＞10.0 mmol/L的小鼠視為模型建立成功并用于后續(xù)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)。

3.3 不同組小鼠體重情況

不同組小鼠體重情況如圖1所示。圖中可見，對(duì)照組小鼠體重隨著時(shí)間緩慢上升，而經(jīng)過(guò)四氧嘧啶誘導(dǎo)后，小鼠出現(xiàn)了糖尿病典型的體重減輕現(xiàn)象。觀察比較模型組和咀嚼片組片，發(fā)現(xiàn)2組小鼠體重均隨著時(shí)間緩慢上升，但是咀嚼片小鼠體重顯著高于模型組，結(jié)果顯示，灰樹花咀嚼片能夠緩減糖尿病造成的體重減輕。

圖1 各組小鼠體重情況

3.4 飲食與飲水情況

造模后，相較對(duì)照組、糖尿病組和治療組小鼠出現(xiàn)較顯著的多飲、多食等典型糖尿病癥狀。但是，給予灰樹花咀嚼片灌胃治療14 d后，治療組小鼠的飲水量顯著低于糖尿病組（圖2(a)），且治療組小鼠飲食量總體低于糖尿病組（圖2(b)）。這說(shuō)明灰樹花咀嚼片能夠緩解糖尿病小鼠多飲、多食等癥狀。

圖2 各組小鼠飲食與飲水情況

3.5 空腹血糖水平變化情況

在腹腔注射四氧嘧啶前各組小鼠血糖均無(wú)顯著差異，且處于正常水平；造模3 d后給予四氧嘧啶的小鼠血糖水平均顯著高于對(duì)照組，且其組間無(wú)顯著差異；通過(guò)給藥1周后觀察可知，咀嚼片組血糖水平低于模型組（p＜0.05）；給藥2周后，咀嚼片組血糖水平依舊顯著低于糖尿病組（p＜0.05），如圖3所示。

圖3 空腹血糖水平比較分析

3.6 糖耐量實(shí)驗(yàn)及其曲線下面積變化情況

口服糖耐量實(shí)驗(yàn)（OGTT）可以觀察小鼠耐受葡萄糖的能力以及小鼠β細(xì)胞功能。OGTT結(jié)果顯示，糖尿病組小鼠血糖波動(dòng)較大，經(jīng)治療后的小鼠血糖水平變化趨于平緩（見圖 4），且各組 OGTT曲線下面積（AUC）計(jì)算結(jié)果顯示（見圖5），治療組小鼠的口服糖耐量的AUC明顯低于糖尿病組（p＜0.05）。這說(shuō)明在經(jīng)過(guò)予灰樹花咀嚼片治療后，糖尿病小鼠的血糖調(diào)節(jié)功能明顯改善。

圖4 口服糖耐量實(shí)驗(yàn)

圖5 口服糖耐量曲線下面積比較分析

4 結(jié)語(yǔ)

本實(shí)驗(yàn)內(nèi)容涵蓋了上游原料藥的發(fā)酵提取、下游制劑產(chǎn)品的開發(fā)與質(zhì)量控制、藥理學(xué)評(píng)價(jià)，實(shí)驗(yàn)內(nèi)容豐富，通過(guò)本教學(xué)項(xiàng)目的實(shí)施可促進(jìn)制藥工程專業(yè)學(xué)生建立全產(chǎn)業(yè)鏈的概念，為將來(lái)從事食品、保健食品、藥品領(lǐng)域工作奠定良好基礎(chǔ)。上游發(fā)酵提取引入了一定規(guī)模的發(fā)酵罐培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，使實(shí)驗(yàn)更好地結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，不僅有助于進(jìn)一步鞏固學(xué)生微生物操作技能，還可促進(jìn)學(xué)生建立制藥工程概念；下游試驗(yàn)中采用了工業(yè)規(guī)模的制劑制備以及質(zhì)量控制設(shè)備，使學(xué)生獲得藥物制劑的生產(chǎn)工藝和質(zhì)量控制專業(yè)知識(shí)，為從事藥品的開發(fā)與生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。藥理學(xué)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)要求學(xué)生熟練掌握動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技能以及數(shù)據(jù)分析能力，對(duì)培養(yǎng)學(xué)生綜合實(shí)驗(yàn)技能和提高科研素養(yǎng)具有重要的意義。