耐受性樹突狀細胞的研究進展

孫廬云,丁 喆,陳 鵬,劉 鋒,寶福凱*,胡明道*

(昆明醫科大學a．第二臨床學院;b．病原生物學與免疫學系,中國云南昆明650500)

樹突狀細胞(dendritic cell,DC)是機體內最強的抗原呈遞細胞,在激活適應性免疫和促進免疫耐受過程中均發揮著重要作用,其中能夠誘導免疫耐受的DC群被定義為耐受性樹突狀細胞(tolerogenic dendritic cell,tolDC)。tolDC可誘導移植后同種異體移植物的持久免疫耐受性,抑制移植排斥反應與自身免疫疾病的發展[1]。實施器官移植術后的病人需終身服用免疫抑制劑,但長期服用免疫抑制劑易產生耐藥性和藥毒性,還可能引起機體更嚴重的排斥反應[2]。機體的免疫耐受性決定了受體對供體器官的接受程度。因此,提高受體免疫耐受性可顯著降低移植術后的排斥反應及相關并發癥,增加供體器官存活率,提高患者的生活質量。目前,多項研究揭示了tolDC應用于移植和自身免疫性疾病治療的機制,這對減少移植排斥后的感染和其他病變的發生具有重要意義。

1 tolDC誘導免疫耐受

T細胞應答是機體對抗原產生免疫反應的關鍵環節,DC可誘導T細胞的活化與耐受,具有雙重功能。DC在體內識別抗原后通過3個階段激活T細胞增殖。首先通過主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex,MHC)和T細胞受體(T cell receptor,TCR)結合上調MHCⅡ,然后共刺激因子和共刺激因子受體結合,上調CD80和CD86的表達,最后刺激T細胞生長因子,促進T細胞增殖。與免疫刺激相反,進入外周組織定居分化的tolDC向T細胞呈遞抗原后則表現出免疫抑制。

tolDC由未成熟樹突狀細胞(immature dendritic cell,imDC)和半成熟樹突狀細胞(semimature dendritic cell,semiDC)組成,主要介導T細胞的失活、凋亡以及誘導調節性T細胞(regulatory T cell,Treg)的生成。未成熟的DC低表達CD80、CD86、CD40和MHC,這些因子是激活T細胞所必需的輔助因子。因此,由于缺乏多種共刺激分子,imDC和semiDC不能活化T細胞,這導致抗原提呈后T細胞的無能或低能反應。此外,tolDC表達吲哚胺2,3雙加氧酶(indoleamine 2,3 dioxygenase,IDO),IDO可催化色氨酸降解為各種色氨酸衍生的代謝物,進而干擾T細胞生長周期、抑制T細胞增殖和促進T細胞凋亡;tolDC還過度表達抑制性分子,如人類白細胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)、程序性死亡配體-1/2(programmed death ligand-1/2,PD-L1/2),以及增加其致耐受性潛力的半乳凝素[3～5]。另外,tolDC亦可通過表達血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)抑制T細胞、自然殺傷細胞(natural killer cell,NK cell)的活性,與Treg建立抑制性反饋回路,同時HO-1能誘導血紅素的分解代謝,而分解產生的一氧化碳可通過線粒體依賴性機制調節DC免疫原性。當用特異性HO-1誘導劑誘導tolDC后,IL-12p70表達降低,IL-10表達升高,tolDC耐受性增加;若阻斷HO-1,tolDC的免疫調節能力將會喪失[6]。研究證明,在小鼠心臟移植中應用特異性的HO-1誘導劑可抑制DC成熟和同種異體T細胞增殖,從而延長同種異體移植物存活時間和延緩移植物排斥反應[7]。

Treg是維持機體免疫耐受的重要因素。tolDC通過細胞-細胞接觸依賴信號、分泌靶向蛋白和細胞因子等機制來誘導Treg生成[8]。在器官周圍的淋巴管中,tolDC分泌的IL-10可調節CD4+CD25+Foxp3+T細胞(Treg)的分化和增殖[9];PD-L1與PD-1(programmed cell death-1)在T細胞上相互作用后加強Foxp3蛋白的表達,誘導T細胞失活,促進Treg生成[10]。而Treg通過分泌IL-10、轉化生長因子-β (transforming growth factor-β,TGF-β)下調DC表面MHCⅡ類分子和共刺激分子的水平,當DC成熟度下降,不能有效刺激T細胞的增殖反應時,則通過負反饋機制激活更多Treg細胞的生成[11]。此外,Treg對DC具有較強的粘附性,導致FasCIN(actin bundling protein)不能與DC有效結合,FasCIN是免疫突觸形成中的一種重要肌動蛋白[12],對維持DC未成熟狀態和耐受性具有重要意義。由此可見,tolDC能誘導機體生成Treg,Treg亦能調節tolDC的耐受性,tolDC和Treg的相互作用對誘導免疫耐受起了重要作用。

2 tolDC的體外誘導培養

tolDC主要由人血單核細胞(如CD14+細胞)、嚙齒類動物骨髓細胞、非人靈長類動物CD34+細胞產生。不同的免疫抑制劑應用于自身免疫性疾病和移植后,也可通過不同的生物學機制促進tolDC生成。

2.1 地塞米松誘導培養

研究表明地塞米松(dexamethasone,DEX)可以阻礙DC分化、成熟和誘導凋亡,當聯合使用DEX、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)和IL-4后可在小鼠骨髓細胞、人類單核細胞中誘導培養產生高效耐受的tolDC[13]。不僅如此,DEX誘導產生的tolDC在脫離DEX刺激后仍能保持數天,甚至一周的耐受性[14]。然而,用DEX單一誘導產生tolDC時分化生成的細胞較少,這可能與DEX濃度和暴露于外界的時長有關[13,15]。Lee等[13]研究發現,聯合使用DEX和米諾環素(minocycline,MIN)能有效增加細胞分化的數量;與DEX單一誘導相比,向DEX處理的培養物中加入MIN可使DC的產生增加至約220%,且MIN和DEX聯合誘導產生的tolDC表現出的免疫耐受性至少等于或優于單一誘導產生的耐受性。

2.2 維生素D3誘導培養

維生素D3(vitamin D3,VitD3)是一種多效性激素,可調節機體鈣的平衡,促進固有免疫的同時抑制適應性免疫,其誘導生成的tolDC會分泌大量IL-10,這一方面可促進調節性B細胞(regula tory B cell,Breg)的生成,抑制炎癥反應,降低共刺激因子和MHCⅡ的表達,另一方面還能抑制T細胞活性、遷移和促進Treg生成[16～17]。研究顯示,與其他培養方式相比,VitD3和DEX聯合誘導培養的tolDC更能在營養不良(或缺乏)的內環境中生存,且具有較強的抗氧化能力,同時對同種異體T細胞增殖的抑制作用也要強于單一誘導培養產生的tolDC[18]。

2.3 雷帕霉素誘導培養

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)常被用作抗癌藥物和免疫抑制劑,其中復合物mTORC1(mammalian target of rapamycin complex 1)和mTORC2主要作用于DC。雷帕霉素(rapamycin,RAPA)通過抑制mTORC1減少DC自噬和內源性抗原呈遞功能,降低MHCⅡ和共刺激因子的表達,從而抑制DC成熟,調節DC功能[19]。研究表明,RAPA通過抑制絲氨酸/蘇氨酸(serine/threonine,Ser/Thr)蛋白激酶途徑來抑制T細胞活性并促進Foxp3+Treg細胞分泌,其誘導分化的tolDC應用于小鼠心臟移植模型時能延長移植物的存活時間,間接促進外周免疫耐受和減少移植后的排斥反應[20]。

2.4 細胞因子誘導培養

具有免疫抑制作用的細胞因子具有誘導tolDC生成的功能,如γ干擾素(interferon-γ,IFN-γ)、肝細胞因子和IL-12[21]。本實驗室前期通過在體外恒河猴骨髓CD34+細胞中加入重組GMCSF、IL-4和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)得到了高純度且典型的 tolDC[22]。不同的細胞因子所誘導培養的DC在功能上有一定差異。IL-10和TGF-β誘導培養的tolDC已廣泛應用于動物實驗和人類自身免疫性疾病的試驗中。研究表明,IL-10和TGF-β誘導培養的tolDC具有更強的免疫耐受表型和促腫瘤逃逸作用[23];IL-10誘導生成的tolDC可以高表達CCR7,具有較強的遷移能力,且能誘導CD4+和CD8+T細胞抗原特異性失活及Treg生成[24]。另外,Boks等[25]發現IL-10誘導培養的tolDC在免疫耐受性和抑制 T細胞活性方面優于 VitD3、DEX、RAPA和TGF-β誘導培養的tolDC。因此,在免疫耐受治療中IL-10誘導培養的tolDC被認為是最佳選擇。最新研究發現,CD141和CD163可穩定地高表達于IL-10體外誘導培養的tolDC表面,這對篩選tolDC具有重要意義[26]。TGF-β誘導的tolDC一方面提供上調PD-L1,促進T細胞失活;另一方面通過下調MHC和共刺激因子的表達,抑制DC抗原呈遞能力,從而維持DC的未成熟狀態[12]。不同誘導劑量的IFN-γ對DC成熟度有一定影響,通常低劑量IFN-γ可誘導生成tolDC。Li等[27]發現IFN-γ通過犬尿氨酸-AhR途徑維持IDO在tolDC中的表達,而受此影響生成的Treg對腫瘤細胞識別具有較強的敏感性。

除了上述幾種誘導方法外,其他一些免疫抑制劑也可促進tolDC生成,例如:麥考酚嗎乙酯[28]在嚙齒類動物實驗模型中被證實具有延長移植物存活時間、抑制T細胞增殖和DC成熟的功能;維甲酸[29]通過干擾NF-κB通路,抑制DC成熟和IL-12p70分泌。總的來講,不同免疫抑制劑具有不同的細胞毒性,誘導分化和生成的tolDC的特征也各不相同(表1),因此,針對不同情況,應選擇合適的體外誘導培養方法。

表1 不同體外誘導方法培養的tolDC的特征Table 1 The characteristics of tolDC cultured with different methods in vitro

3 tolDC相關的miRNA調控機制

miRNA是一種微小的調控性非編碼RNA,它通過抑制轉錄或加速目標mRNA的降解,最終導致靶蛋白的合成受到抑制[30]。DC是啟動、調控并維持免疫應答的中心環節。目前越來越多的研究表明,miRNA參與調控了DC的發育分化、成熟、抗原提呈、活化T細胞功能及細胞因子的釋放[31]。當機體受到外界刺激時,體內miRNA的表達會受到影響,其通過介導對DC功能的調控,進而影響機體免疫應答的過程。

miR-let-7i是最早發現的miRNA之一,當抑制miR-let-7i表達時,DC表面共刺激因子CD80、CD86的表達下調,同時促炎因子的表達下降,活化T細胞的能力降低,導致DC耐受性增加;此外,miR-let-7i的低表達還可以促進Treg生成[32]。相關研究報道,miR-let-7i通過結合SOCS1(suppressor of cytokine signaling 1)和BLIMP(B lympho cyte-induced maturation protein-1)的 3′非翻譯區(3′-untranslated region,3′-UTR)影響 DC 的分化成熟,誘導T細胞低反應性[33]。另有研究表明,miR-203在tolDC中的表達顯著上調,而miR-135a的表達則顯著下調,前者的作用靶點是SOCS3,SOCS3表達下調會持續激活STAT3信號通路,引起白細胞浸潤,促炎因子IL-6分泌增多,最終影響tolDC的耐受性[34～35];后者會引起GATA-3(GATA binding protein-3)表達升高,IFN-γ表達減少,從而干預機體Th1/Th2平衡的調節過程,影響tolDC生成[36]。影響DC分化過程中很重要的一條通路便是Notch/Wnt信號通路。研究報道,miR-125a和miR-99b能共同調控Wnt1和JAG1(Notch 的配體)的表達,促進 DC 的分化[37～38]。miR-23b亦可抑制Notch/Wnt信號通路,除此之外,它還能抑制NF-κB信號通路,進而促進DC耐受性增加和Treg生成[39];miR-214促進Treg生成則是通過β-catenin信號通路[40]。另一方面,當DC受到Toll樣受體和非Toll樣受體刺激后能分泌一些細胞因子,這些細胞因子可參與T細胞分化過程,如IL-10和IL-17;其中,IL-17的表達受到miR-133b的調控,且miR-133b特異性表達于TH17細胞[41]。以上miRNA調節DC耐受性的主要過程如圖1所示。另外,miRNA調控tolDC的具體靶標及相關研究可見表2。綜上可知,一種miRNA可以調控多種信號通路,其通過不止一種機制調控DC以影響其耐受性,且同一靶標可能受多種miRNA調控。

miRNA廣泛分布于動物體內,通過轉錄后水平的調節,參與細胞的生命活動,間接在固有免疫和適應性免疫系統中發揮著至關重要的作用[31]。一種miRNA可以調控的mRNA不止一種,不同的靶基因通過不同的途徑影響著DC的耐受性,通過增加DC的耐受性,間接增強了移植物的耐受性、延緩了免疫排斥反應和自身免疫性疾病的發展,體現了基因靶向治療在移植和自身免疫性疾病中的潛在應用價值。本課題組在前期培養、鑒定恒河猴骨髓來源的imDC[22]基礎上,建立了恒河猴肝移植模型,著重研究抑制DC細胞miR-let-7i和miR-155后,恒河猴肝移植免疫耐受發生的機制。然而,復雜的調控網絡之間關系錯綜復雜,不同的調控之間是否有聯系還值得進一步探索。近年來,研究者對于miRNA調控機制的研究取得了較大進展,這有助于為進一步尋找依賴于tolDC的免疫治療提供新思路。

表2 miRNA通過特定靶點調控tolDCTable 2 tolDCs regulated by miRNAs through specific targets

4 tolDC的應用

4.1 tolDC在移植中的應用

圖1 miRNA介導的DC耐受性調節不同顏色的miRNA代表不同的狀態,其中紅色表示miRNA上調,綠色表示miRNA下調。miRNA介導DC耐受性增加的機制亦用不同顏色標識,其中紅色表示生成增多,綠色表示生成減少或受抑制。Fig.1 Regulation of DC tolerance through miRNAsDifferent colors represent different states of miRNAs．Red represents the upregulated miRNAs,and green represents the downregulated miRNAs．Mechanisms which mediate increased tolerance of DCs by miRNAs are marked in different colors,with red indicating increased production and green indicating decreased production or suppressed state．

當患者對免疫抑制劑敏感或耐藥時,tolDC注射已成為一種新型輔助治療方式,其可通過改變DC和T細胞的反應來減少排斥反應。在嚙齒類動物模型中,移植前一周向受體體內輸注供體tolDC可延長移植物存活時間[42]。Peng等[43]用半乳凝素-1誘導的供體源性tolDC聯合凋亡淋巴細胞注射后提高了Treg的反應性,促進了T細胞凋亡,從而延長了肝移植物的存活時間。在恒河猴的腎移植模型中,研究人員分別采用靜脈注射和脈沖式靜脈注射的方式向受體猴輸入由VitD3和IL-10刺激產生的供體源性tolDC,結果顯示:采用靜脈輸注方式輸入供體源性tolDC后,移植物中供體的反應性記憶T細胞選擇性減弱,同時CTLA4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4)和PD-1的表達上調,腎移植物存活時間延長[44];采用脈沖式靜脈輸注方式輸入供體源性tolDC后,受體中IL-17的表達降低,T細胞反應性下降,腎移植物存活時間延長[45]。Zahorchak等[46]通過人血分離模擬實驗證實VitD3和IL-10誘導分化的tolDC在抗成熟性方面優于其他誘導劑產生的tolDC;在tolDC中PD-L1/CD86比例越高,細胞效能則越好。目前,匹茲堡大學醫學中心已將供體源性的由VitD3和IL-10誘導分化的tolDC聯合霉酚酸應用于肝移植的臨床Ⅰ期試驗[47]。就tolDC的來源而言,在促進移植物存活方面,供體源性tolDC由于缺乏MHC、共刺激因子和促炎性因子的表達,更能促進特異性免疫耐受;從治療價值考慮,供體源性tolDC也要優于受體源性tolDC[48]。當然,在移植中,炎癥反應和某些免疫抑制劑的應用也可能引起細胞壞死或應激細胞的吞噬,刺激DC分化為成熟的免疫原性細胞,干擾tolDC免疫表型的穩定,影響tolDC的耐受性;盡管如此,已有臨床研究表明,免疫抑制劑聯合應用比單一應用療效好,且不會干擾tolDC的活性[49]。綜上所述,對于移植的細胞治療而言,tolDC的來源、誘導方法、輸注方式等均可能與其治療效果息息相關。

4.2 tolDC在自身免疫性疾病中的應用

tolDC治療已廣泛應用于自身免疫性疾病的臨床試驗中,對某些疾病治療的可行性已得到證實,如類風濕性關節炎、克羅恩病、Ⅰ型糖尿病等[50]。在多發性硬化癥和視神經脊髓炎的1b期臨床試驗中,Nafarrate等[51]將體外誘導培養出的tolDC使用致病性自身抗原負載,再重新輸入人體內實施治療,結果顯示:患者體內IL-10增加,IFN-γ減少,且Th0細胞向Th2細胞分化。抗原負載的tolDC治療是一種特異性的治療方法,不僅可模擬抗原和DC結合,直接刺激效應細胞,還能誘導產生抗原特異性效應T細胞。在Ⅰ型糖尿病的臨床Ⅰ期試驗中,Giannoukakis等[52]用針對CD40、CD80和CD86的反義寡核苷酸誘導培養的免疫抑制性tolDC治療后發現,皮內給藥較靜脈給藥更易產生免疫耐受性,且患者無明顯不良反應;同時,應用自體tolDC治療的患者其體內B220+CD11c-B細胞有效增加,但tolDC的療效暫未得到證實。在大多數類風濕性關節炎患者中人們檢測出了抗瓜氨酸抗體,瓜氨酸是合成L-精氨酸的前體,L-精氨酸具有抗排斥和增強免疫耐受的功能,Benham等[53]采取瓜氨酸抗原負載的tolDC對患者實施治療后發現,Treg/T細胞比值增加,DAS28下降,且未誘發類風濕性關節炎的發作。此外,在治療系統性紅斑狼瘡方面,有研究者提出通過靶向患者體內的DC并改變細胞表型促使其轉換為tolDC,或通過基因工程技術改造tolDC,誘導患者體內生成特異的Treg[54]。由于各種自身免疫性疾病的發病機制不同,且患者的遺傳背景也不同,因此tolDC的免疫療法需視具體情況選擇。隨著二代測序技術的普及,tolDC轉錄譜特征[26,55]的分析對研究tolDC細胞表型、生物標記物具有重要意義,可為tolDC的免疫療法奠定基礎。

5 結語與展望

tolDC在抑制器官移植排斥和防止自身免疫疾病中有著廣泛的應用前景,受到越來越多學者的重視。tolDC是適應性免疫反應的基礎,可由多種藥物誘導產生,且不同藥物誘導的tolDC具有其獨特的功能,這在不同的移植物、自身免疫性疾病實驗模型和臨床應用中已得到相應證實。值得注意的是,器官存在其獨特的免疫耐受性,如肝移植術后,受體可在不服用任何抗排斥藥的情況下對移植物不產生排斥反應。這可能與tolDC通過不同的外周免疫耐受途徑介導移植免疫耐受和延長移植物存活時間有關,而tolDC具體如何識別相應途徑和調節細胞因子,部分機制仍未清楚。另外,為了防止使用tolDC時對機體造成其他不良的免疫反應,應用于人體治療的tolDC在功能穩定性、抗成熟性、純度和數量等方面都具有較高的要求。因此,仍需要通過更多動物模型、體內實驗尤其是臨床試驗來探索tolDC發揮免疫耐受的機制,這對將來移植免疫耐受和自體免疫性疾病的防治具有重大意義。